은편모류(Cryptophyceae)는 2개의 편모를 가지며 세포는 2-40 µm까지 다양한 크기를 가진다. 전 세계적으로 약 200여 종이 담수와 해수, 기수역 등 모든 수계에서 서식하고(Klaveness, 1988; Metfies and Medlin, 2007), 때로는 적조를 일으키기도 한다(Novarino, 2003). 최근 해양 일차생산자 중 매우 작은 크기의 미세플랑크톤에 주목하면서 한국 연안에서도 은편모류가 시기적으로 우점하는 분류군으로 확인되고 있다(국립수산과학원 적조속보).

은편모류의 먹이 가치에 대해서는 최근 연구가 활발히 진행되고 있는데, 수산양식용 먹이로 활용하기 위해 일반 영양성분을 포함한 아미노산 및 지방산 조성에 관한 연구(Volkman et al., 1989; Brown, 1991; Zhukova et al., 1995; Brown et al., 1997)에서 종주에 따라 단백질 53-64%, 지질 18-28%, 탄수화물 9-24%를 함유하는 것으로 분석되었고, 특히 해산동물에 필요한 고도불포화지방산 함량이 높은 것으로 보고되었다. 또한 은편모류를 굴 치패(Brown et al., 1998; McCausland et al., 1999)과 가리비 부유유생(Tremblay et al., 2007)에 공급한 결과, 기존의 미세조류 먹이보다 성장률이 좋거나 타 광생물 먹이와 혼합할 경우 지질함량을 향상시켰다.

또한 은편모류를 동물플랑크톤인 요각류의 먹이로 공급하여 성장 및 알 생산력을 증가시켰고(Stottrup et al., 1999; McKinnon et al., 2003; Knuckey et al., 2005; Dahl et al., 2009), 어류 및 갑각류 종묘생산 시 동물먹이로 이용되는 Artermia의 영양을 증진시킨(Thinh et al., 1999) 사례가 있어, 해양의 다양한 동물의 먹이가 되고 있음을 의미한다.

그러나 지금까지 먹이생물로써 사용된 은편모류는 대부분 Chroomonas 속이나 Rhodomonas 속에 속한 종이었으며, 본 연구에서 대상으로 하는 Teleaulax 속에 속한 종류는 아직 사용된 예를 찾을 수 없을 정도로 거의 처음으로 시도되는 대상이다.

본 연구는 한국 연안에서 채집된 은편모류를 대상으로 먹이생물로서의 가능성을 검증하기 위해 다양한 은편모류 종주를 사용하여 동물성 먹이생물인 윤충류의 성장 및 포란율을 기준으로 우수 종주를 선발한 후, 이들 우수 종주와 기존의 먹이생물로 활용되고 있는 미세조류를 윤충류 및 이매패류 유생(바지락, 굴)에 공급하여 성장 또는 생존율을 비교하였다

은편모류 종주를 순수 분리하기 위해 우리나라 서해 및 남해와 제주해역에서 해수를 채수하여 실험실에서 은편모류를 미세관 피펫을 이용하여 광학현미경(Olympus BX-50) 하에서 1세포씩 분리하였다. 그 후 분리된 세포를 30 psu로 조절되고 규소 성분을 제외시킨 f/2 (f/2-Si) 배지가 담긴 24-well culture plate에 넣고, 20℃, 50 μE m⁻²s⁻¹에서 배양하였다. Culture Plate에서 타 well에 비해 성장이 우수한 것으로 확인된 종주는 실험실 배양시스템[20℃, 연속광(L:D=24:0), 50 μE m⁻²s⁻¹]에서 연안해수를 30psu로 조절한 후, f/2-Si 배지를 사용하여 계대배양을 통해 종주를 유지시키면서 실험에 사용하였다.

본 연구를 위해 확보된 신규 먹이생물 종주는 18S rDNA 유전자 분석을 통해 은편모강(Cryptophyceae)에 속하는 Teleaulax amphioxeia 임을 확인하였고(Table 1), 세포의 길이는 9.6±0.3 µm, 폭은 4.7±0.3 µm이었다.

윤충류의 초식률

어류 및 갑각류 종묘생산 시 이용되고 있는 동물 먹이생물인 윤충류 B. plicatilis(강릉원주대학교 해양생명공학부 먹이생물 연구실 분양 제공)를 대상으로 신규 은편모류 5개 종주(KNU CR-MAL 01, 07, 08-1, 08-2, 09)에 대한 먹이농도별 초식률(Grazing Rate)을 측정하였다. 은편모류 T. amphioxeia는 각각 25,000, 50,000, 100,000, 150,000, 200,000 cells mL⁻¹ 농도가 되게 하여 100 mL 삼각플라스크(배양수 80 mL)에 채우고, 윤충류 B. plicatilis를 2 inds. mL⁻¹로 접종한 후 시간 경과(0.5, 1, 2, 3, 6, 12, 24 h)에 따른 먹이의 농도 변화를 확인하였다. 시간 경과에 따라 배양수 중 먹이가 고루 분포하도록 한 후 1 mL를 취하여 루골용액(Lugol’s solution)으로 고정한 다음 Sedgwick-Rafter Chamber를 이용하여 광학 현미경 하에서 3회 반복 계수한 후 평균값을 산출하여 mL당 농도로 환산하였다. 배양조건으로 수온(25℃) 및 염분(30 psu)을 설정하고, 광주기는 24시간 연속적으로 유지하였다. 먹이농도 변화에 따른 윤충류 B. plicatilis의 초식률(Gr)은 Omori and Ikeda (1984)를 참고하여 다음 식을 이용하여 산출하였다.

Gr= V(C₀−C_t) / N × t

V : 부피(mL) C0와 Ct : 각각 초기 및 최종 먹이농도(cells mL−1) N : 윤충류의 개체수 t: 배양시간 (h)

윤충류의 성장 및 포란율

윤충류의 성장 및 포란율을 측정하기 위해 은편모류 5개 종주(CR-MAL 01, 07, 08-1, 08-2, 09)를 이용하여 2.0×10⁵ cells mL⁻¹의 농도로 공급하였으며, 수온(25℃)과 염분(30 psu)을 설정한 후 윤충류를 5 inds. mL⁻¹를 접종하여 7일 동안 연속광(L:D=24:0)에서 배양하였다. 윤충류의 개체수와 포란 개체의 계수는 매일 1 mL씩 추출하여 해부 현미경 하에서 이루어졌으며, 계수된 개체들은 시험관에 재수용하였다. 윤충류의 성장은 순간성장률(Instantaneous growth rate, r 또는 증식률)로써 Rico-Martinez and Dodson (1992)에 따라 계산되었다.

r=(1/t) ln(N_t /N₀)

Nt: 시간 t에서 윤충류의 개체수 N0 : 윤충류의 초기 개체수 t : 배양시간 (days)

윤충류의 성장 및 포란율 비교

윤충류의 성장 및 포란율을 비교하기 위해 신규 은편모류 종주 CR-MAL 08-2와 기존의 해산 클로렐라 Chlorella ellipsoidea (한국미세조류은행 KMMCC-2)를 선택하여 비교하였다. 각 먹이의 탄소량을 측정한 결과 C. ellipsoidea의 탄소량이 CR-MAL 08-2보다 2.5배 높은 것을 감안하여 CR-MAL 08-2 종주는 5.0×10⁵ cells mL⁻¹로 C. ellipsoidea는 2.0×10⁵ cells mL⁻¹로 구분하여 윤충류에 공급하였다. 비교실험은 7일 동안 연속광(L:D=24:0)에서 수온(25℃)과 염분(30 psu)을 설정한 후 윤충류를 5 inds. mL⁻¹로 접종하였다. 매일 실험수 1 mL씩을 추출하여 해부현미경 하에서 윤충류의 개체수와 포란 개체를 계수하였고, 계수된 개체들은 시험관에 재수용 하였다. 실험 대상 종의 순간성장률(Instantaneous growth rate, r)의 계산은 앞에서 기술한 Rico-Martinez and Dodson (1992)의 식에 의해 계산하였다.

바지락 부유유생

바지락 Ruditapes philippinarum D형 부유유생의 먹이실험은 전라북도 수산기술연구소에서 배양 중인 부화 후 3일이 경과된 개체를 대상으로 하였다. 은편모류 T. amphioxeia의 3개 종주(CR-MAL 07, 08-1, 08-2)를 이용하여 1.0×10⁴ cells mL⁻¹로 먹이를 공급하였으며, 3 L 비커(배양수 2 L)에 바지락 유생을 1 inds. mL⁻¹로 수용하였다. 수온과 염분은 각각 20℃와 30 psu를 유지하였고, 광주기는 24시간 연속적으로 유지하였다. 실험은 12일간 시행하였으며, 실험이 종료된 후에 바지락 유생의 성장(각장, 각고)과 생존율을 조사하였다.

굴 부유유생

굴 Crassostrea gigas의 D형 부유유생은 민간이 운영하는 패류종묘생산장(경남 거제시 성포면)에서 수온 약 20℃, 염분 약 30 psu에서 배양하던 것을 실험실로 옮겨와 다음 날 실험에 사용하였다. 은편모류 2개 종주(CR-MAL 07과 08-2)와 기존에 사용되는 식물 먹이생물인 Chaetoceros sp. 및 Isochrysis aff. galbana 등 4 종류의 먹이를 단독 또는 혼합하여 총 7개의 실험구로 설정한 후, 최종 먹이농도 3.0×10⁴ cells mL⁻¹로 공급하였으며, 1 L 비커(배양수 800 mL)에 굴을 20 inds. mL⁻¹로 수용하였다. 실험의 수온과 염분은 각각 20℃와 30 psu를 유지하였고, 광주기는 24시간 연속적으로 유지하였다. 실험은 10일간 시행하였으며, 실험이 종료된 후에 굴 유생의 성장(각장, 각고)과 생존율을 조사하였다. 먹이 공급 형태는 다음과 같이 7가지 방법(①Chaetoceros sp., ②Isochrysis aff. galbana, ③Teleaulax amphioxeia CR-MAL 08-2, ④T. amphioxeia CR-MAL 07, ⑤T. amphioxeia CR-MAL 08-2 + I. galbana, ⑥T. amphioxeia CR-MAL 07 + I. galbana, ⑦T. amphioxeia CR-MAL 08-2 + CR-MAL 07 + I. galbana)으로 공급하였다.

바지락과 참굴 부유유생에 공급되는 식물 먹이생물은 후기 지수성장기의 세포를 수확한 후 원심분리하여 공급하였다.

모든 실험은 SPSS program (ver. 12.0)을 이용하여 One-way ANOVA test를 실행한 후 Duncan's multiple range test (Duncan, 1955)로 평균 간의 유의성(P=0.05)을 검정하였다.

은편모류(Teleaulax amphioxeia, KNU CR-MAL 01, 07, 08-1, 08-2, 09)에 대한 24 시간 후 먹이 농도별 윤충류의 초식률을 조사한 결과를 Fig. 1과 Table 2에 나타내었다. 각 종주별 최대 섭식률은 상호 유의한 차이를 발견하지 못하였으나, CR-MAL 08-1 실험구를 제외한 나머지 실험구에서 먹이 농도가 증가할수록 윤충류의 시간당 초식률이 증가하는 경향을 보였다. 은편모류 종주별 최고 초식률은 1.50×10⁶−1.84×10⁶ cells inds.⁻¹ h⁻¹의 범위를 보였으며, CR-MAL 09에서 가장 높은 초식률을 나타냈다. 다음으로는 CR-MAL 08-2 실험구에서 1.82×10⁶ cellsinds.⁻¹ h⁻¹의 초식률을 보였으며, CR-MAL 07 실험구에서는 1.66×10⁶ cells inds.⁻¹ h⁻¹의 초식률을 나타냈다. CR-MAL 01 실험구에서는 1.53×10⁶ cells inds.⁻¹ h⁻¹의 초식률을 보였고, 가장 낮은 초식률을 나타낸 실험구는 CR-MAL 08-1이었다.

실험에 사용한 은편모류 5개 종주 중 1개의 종주 만을 제외하고는 먹이농도 2.5×10⁴−2.0×10⁵ cells mL⁻¹에서 윤충류의 초식률이 감소하지 않고 계속 증가하였다. 그러나 종주 CR-MAL 08-1에 대해서는 최대 농도인 2.0×10⁵ cells mL^-1에서 감소하였다. .

은편모류 먹이 종주에 따른 윤충류 성장과 관련하여 최대 밀도, 포란율, 비성장률의 결과를 Table 3에 나타내었다. 윤충류의 밀도는 모든 실험구에서 배양시간이 경과함에 따라 증가하는 경향을 보였으며, 상대적으로 높은 밀도를 보인 실험구는 CR-MAL 01과 08-1, 08-2로 배양 7일 째 평균 44-50 inds.mL^-1이었고, 그 외 실험구의 평균 20-32 inds. mL⁻¹보다 유의적으로 더 높은 성장을 나타냈다(P<0.05).

최고 밀도에서의 포란율은 CR-MAL 07에서 평균 23.6%로 최저이었고, CR-MAL 01에서 평균 37.2％로 가장 높았으나(Table 3), 각 종주 간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다(P>0.05).

성장률로써 최고 밀도에서의 순간성장률(Instantaneous growth rate, r 또는 증식률)은 CR-MAL 07에서 평균 0.26으로 가장 낮았고, CR-MAL 08-2에서 평균 0.33으로 가장 높았으며, 이들 두 종주 간에는 유의적인 차이가 있었으나(P<0.05), 나머지 종주들과는 유의한 차이가 없었다(Table 3).

본 연구에서 성장이 좋았던 은편모류 종주 CR-MAL 08-2와 Chlorella ellipsoidea를 각각 섭식한 두 그룹의 윤충류 성장률 결과를 Table 4에 나타내었다. 두 먹이 종류 모두에서 시간이 경과함에 따라 윤충류의 성장으로써 개체수 밀도가 증가하는 경향을 보였으며, 각 최고 밀도는 배양 7일 째 각각 평균 67 inds. mL⁻¹와 52 inds. mL⁻¹로 Chlorella를 섭이한 윤충류의 밀도가 약간 더 높았다(P<0.05). 포란율(fecundity rate)은 은편모류 섭식 윤충류에서는 평균 42.5%, Chlorella 섭식 윤충류에서 평균 40.2%였으나 둘 사이에 유의적인 차이는 없었다(P>0.05). 순간성장률(Instantaneous growth rate, r)은 Chlorella 섭식 윤충류가 평균 0.37로 은편모류 CR-MAL 08-2를 섭식한 윤충류의 0.34보다 유의적으로 약간 높은 성장률을 나타냈다(P<0.05). 따라서 은편모류 CR-MAL 08-2 종주를 섭식한 윤충류는 C. ellipsoidea를 섭식한 윤충류보다 성장률은 낮았으나 포란율은 약간 더 높았다.

은편모류 T. amphioxeia의 일부 종주(CR-MAL 07, 08-1, 08-2)를 공급하여 바지락 Ruditapes philippinarum 부유유생의 성장과 생존율을 Table 5에 나타내었다. 각장과 각고에 대한 성장은 먹이인 은편모류의 종주에 따라 다소 차이가 나타났다. 대체로 CR-MAL 08-1과 08-2 실험구에서 좋은 성장을 나타냈다.

바지락 부유유생의 최종 생존율을 비교해 본 결과, 각 실험구 별로 유의한 차이는 없었으나, CR-MAL 07과 08-2 실험구에서 평균 약 40% 전후의 높은 생존율을 보였다. 비교적 좋은 성장을 보였던 CR-MAL 08-1 실험구에서는 약 36%의 생존율을 나타냈다.

은편모류 2개 종주(CR-MAL 07, 08-2)와 Chaetoceros sp., Isochrysis aff. galbana 4종류의 먹이를 공급하여 굴 부유유생의 성장과 생존율을 Table 6에 나타내었다.

각장에 대한 성장 결과를 살펴보면, CR-MAL 08-2+I. galbana를 공급한 실험구에서 평균 각장 크기가 143.5 µm로 유의적으로 가장 높은 성장을 나타냈다(P<0.05). 그 다음으로 I. galbana 및 CR-MAL 08-2 실험구에서는 각각 평균 각장 129.0 µm와 120.7 µm를 나타냈으며, CR-MAL 08-2+ CR-MAL 07+I. galbana를 공급한 실험구는 평균 각장 113.3 µm를 나타냈다. 그 다음으로는 평균 각장 101.7 µm와 101.3 µm를 나타낸 CR-MAL 07+I. galbana와 CR-MAL 07 실험구이었고, 가장 낮은 성장을 보인 실험구는 Chaetoceros sp.를 단독으로 공급한 실험구(Ch)로써 평균 각장이 91.3 µm였다. 바지락 부유유생의 각고 성장 결과는 각장 성장과 유사한 결과를 나타냈다.

굴 부유유생의 생존율은 I. galbana를 단독으로 공급한 실험구(Is)에서 63%로 가장 높았다. 각장과 각고에서 가장 높은 성장을 보였던 CR-MAL 08-2+I. galbana실험구는 62.1%를, 그 다음으로는 CR-MAL 08-2 실험구에서 50.4%, CR-MAL 08-2+CR-MAL 07+I. galbana와 CR-MAL 07+I. galbana 실험구는 각각 30.3%, 35.2%의 생존율을 보였다. 가장 낮은 각장 및 각고 성장을 보였던 Chaetoceros sp.를 공급한 실험구(Ch)에서 9.8％로 가장 낮은 생존율을 나타냈다.

실험에 사용한 은편모류(Teleaulax amphioxeia KNU CR-MAL 01, 07, 08-1, 08-2, 09) 5개 종주 중 1개 종주 만을 제외하고는 먹이농도 2.5×10⁴−2.0×10⁵ cells mL⁻¹에서 윤충류의 초식률이 감소하지 않고 계속 증가하였다. 그러나 은편모류 CR-MAL 08-1에 대해서는 최대 농도인 2.0×10⁵ cells mL⁻¹에서 감소하였다.

윤충류 Brachionus plicatilis의 성장은 다양한 종류의 먹이를 대상으로 먹이 농도가 증가할수록 증가하지만 어느 수준 이상에서는 그 성장이 일정한 것으로 알려져 있다(Korstad et al., 1989; Hansen et al., 1997; Navarro, 1999). 본 연구의 실험에서는 거의 대부분의 은편모류 종주에서 윤충류 B. plicatilis의 초식률의 정체기가 나타나지 않았다. 추후 은편모류를 고밀도로 대량 배양한 후 응집 및 연속원심분리 등의 다양한 방법을 적용하여 농축시켜 현재보다 고농도의 먹이를 윤충류에게 공급한다면 윤충류의 최대 성장을 위한 최소한의 먹이농도는 적어도 2.0×10⁵ cells mL⁻¹ 이상에서 나타날 것으로 보이며, 최대 초식률도 1.8×10⁶ cells inds.⁻¹ h⁻¹ 이상으로 될 것으로 판단된다.

Bae and Hur (2011)는 3속의 미세조류를 윤충류 B. plicatilis에 공급한 결과, 각 윤충류의 증식률(specific growth rate, 순간성장률과 동일)은 Nannochloropsis가 가장 높았고, 다음으로 Nannochloris와 Chlorella 순임을 보고하였다. 가장 낮은 증식률(혹은 순간성장률)을 보인 Chlorella의 경우에도 그 값은 약 0.53으로 본 연구의 두 종류의 순간성장률보다 더 높았다. 또 Scott and Baynes (1978)은 Dunaliella tertiolecta, Isochrysis galbana, Pavlova lutheri, Phaeodactylum tricornutum를 먹이로 한 윤충류 B. plicatilis의 성장률(r)값은 0.40-0.54의 범위에 있다고 보고하였다.

앞에서 언급한 성장률(r) 값은 각 연구자마다 실험조건이 다르기 때문에 각각의 성장률(r) 값을 직접적으로 서로 비교하기에는 다소 문제가 있다. Hirayama et al. (1979)는 동일한 실험 조건에서 한 종의 미세조류, 예를 들면, 대조구로서 해산 클로렐라에 대해 임의의 먹이 종의 성장률(r) 값을, 비교하는 성장률(r) 상대치와 순생산속도(R₀)를 이용하여 우수, 보통, 부족의 3등급으로 상대적으로 먹이의 질을 평가하였다. 성장률(r) 값에 대해서만 보면, 본 연구에서 해산 클로렐라 C. ellipsoidea를 먹이로 한 윤충류 성장률(r) 값에 대한 은편모류 CR-MAL 08-2를 섭식한 윤충류 성장률(r) 값의 상대치는 0.91이 된다. 이 결과를 Hirayama et al. (1979)의 등급에 적용하면, 은편모류 CR-MAL 08-2는 윤충류 B. plicatilis 먹이생물로써 해산 클로렐라를 대체할 수 있을 만큼 상대적으로 우수한 먹이가 되는 것으로 판단된다.

이매패류 유생의 먹이로써 미세조류가 갖추어야 할 조건은 형태, 크기, 운동성, 섭식의 용이성, 소화 및 동화, 독성 등 여러 가지가 있다(Marshall et al., 2010). 이러한 조건들이 충족되면 될수록 유생의 성장과 생존율은 좋아질 것이다. 그 중에서도 크기에 관해서는 일반적으로 2-10 µm가 적합한 것으로 알려져 있다(Palmer and Williams, 1980). 본 연구에 사용된 은편모류 T. amphioxeia는 약간 타원형으로 단경이 평균 4.7 µm, 장경이 평균 9.6 µm이고 2개의 편모를 가지고 있어 적당한 운동성이 있어 유생의 기본적인 먹이 조건을 갖추고 있다.

본 연구에서 은편모류를 바지락 유생의 먹이로 12일간 공급한 후의 생존율이 평균 36.2-41.1%였다. 또 굴 유생의 먹이로 10일간 공급한 후의 생존율은 은편모류 종주 각각을 단독으로 공급하였을 때 20.4-50.4%로 나타나 종주에 따라 차이가 컸으며, I. galbana와 혼합하여 공급하였을 때는 30.3-62.1%였고, I. galbana 및 Chaetoceros sp.를 단독으로 공급했을 때의 생존율은 각각 63%와 9.8%였다. 은편모류를 굴 부유유생의 먹이로 사용하였을 때 규조류 Chaetoceros sp.보다는 훨씬 더 좋은 성장률을 나타냈으며, I. galbana를 단독으로 사용 때보다는 다소 낮은 성장률을 나타냈으나, CR-MAL 08-2 종주를 사용했을 때는 거의 비슷한 생존율을 보였다. 또 우수 은편모류 종주를 I. galbana와 함께 혼합했을 때는 I. galbana 단독과 같은 생존율을 보였다.

I. galbana는 패류의 먹이로 폭넓게 이용되는 대표적인 미세조류이다(Helm et al., 2004). 이번 연구에서도 여러 종주의 은편모류 및 규조류 Chaetoceros sp.를 먹이로 사용했을 때보다 더 높은 이매패류 부유유생의 생존율을 보였다. 그러나 앞에서 언급한 바와 같이, 은편모류는 I. galbana보다 세포 크기 및 운동성이 더 크기 때문에 이매패류의 초기 D형 부유유생이 섭식하기에는 다소 어려움이 있을 것으로 판단되나, 은편모류 CR-MAL 08-2는 다른 종주보다 이매패류 부유유생의 생존율이 높았고, 굴 부유유생의 생존율에서도 I. galbana와 거의 비슷한 생존율을 보였다는 점에서 은편모류의 일부 종주는 이매패류 먹이로서 일부 조건을 갖추고 있다고 볼 수 있다.

미세조류가 이매패류 부유유생의 먹이 가치는 주로 지방, 탄수화물, 단백질과 같은 생화학적 조성에 의해 결정되며, 먹이의 영양은 부유유생의 성장과 생존율에 매우 큰 영향을 미친다(Helm et al., 1973; Marshall et al., 2010). 예를 들면, 단백질 함량은 부유유생의 생존율과 양의 상관관계에 있는 것으로 나타났다(Aranda-Burgos et al., 2014). 또 단백질과 지방은 생물체내의 생합성을 위해 사용되지만, 탄수화물은 에너지원으로도 중요하다(Whyte et al., 1989). 향후 은편모류의 지방산을 포함한 영양가를 측정하여 이매패류 부유유생의 성장 및 생존율과의 관계를 분석함과 동시에 타 미세조류와도 비교함으로써 은편모류 T. amphioxeia의 먹이 가치를 영양적인 측면에서도 분석할 필요가 있을 것 같다.