제초제내성 대두가 상업적으로 재배된 1996년 이후 유전자변형(Genetically modified, GM) 작물의 재배면적은 해마다 증가하고 있다. 2011년 전 세계 유전자변형 작물의 재배면적은 1억 6,000만 ha(James, 2011)로, 대한민국 국토면적 (221,336㎢)의 약 7.2배에 해당된다. 유전자변형 작물 중 제초제내성 대두, 옥수수, 유채, 면화의 재배면적은 약 9,400만 ha로 전 세계 유전자변형 작물 재배면적의 59%를 차지하고 있다. 일반적으로 제초제내성 작물은 glyphosate나 glufosinate 제초제에 내성을 가짐으로써 잡초방제에 소요되는 노동력과 농기계 사용 절감에 따른 경제적 이익(Owen, 2000), 무경운농법에 의한 토양 환경 보존 및 화석연료 사용 절감에 따른 기후 변화 대응 효과(Brookes and Barfoot, 2006) 등의 장점이 있다. 반면 도입 유전자의 이동(gene flow)에 의한 슈퍼잡초 발생 가능성(Ellstrand, 1992)과 생태계 교란(Conner et al., 2003) 등의 우려로 유전자변형 작물의 이용에 대한 논란은 계속되고 있다. 현재 국내에서는 유전자변형 작물의 재배가 이루어지고 있지 않지만, 유전자변형 작물 개발 연구의 확대로 상용화에 앞서 유전자변형 작물이 환경에 미칠 수 있는 요인들의 면밀한 분석이 필요하다.

원핵생물은 생존을 위한 방법으로 접합(conjugation), 형질도입(transduction), 형질전환(transformation) 등을 통해 종간 또는 종내에서 유전자 이동이 일어나며(Ochman et al., 2000), 다양한 환경에서 배양 가능한 원핵생물 중 약 90종에 서 유전자 전달이 일어나는 것으로 보고되었다(de Vries and Wackernagel, 2005). 항생제저항성 유전자를 도입한 감자의 in vitro 실험에서는 2 × 10^-17 빈도로 β-lactamase 유전자가 감자줄기썩음병원균 Erwinia chrysanthemi로 이동되었다(Jonas et al., 2001). 따라서 제초제내성 유전자변형 작물의 대규모 재배로 제초제내성 유전자 전달에 의한 생태계 교란 가능성 논란이 제기되기도 하였으나(de Vries and Wackernagel, 2005), 아직까지 포장에서 재배된 유전자변형 작물로부터 세균으로의 유전자 전달에 관한 명확한 증거는 보고된바 없다(Kim et al., 2010). 국내에서는 제초제내성 고추(Lee et al., 2007), 해충저항성 배추(Sohn et al., 2010), 비타민 E 강화 콩(Lee et al., 2011) 등의 형질전환 작물 재배가 근권 토양과 미생물상에 미치는 영향에 대하여 보고된 바 있다.

유전자변형 작물의 상용화를 위해서는 환경위해성 평가를 통한 안전성 검정이 필수적이며, 특히 우리나라에서 주곡으로 오랜 기간 동안 이용해온 벼는 토양 미생물상을 비롯한 농업환경 영향에 대한 자세한 연구가 필요하다. 프로토포르피리노겐 옥시다아제(Protoporphyrinogen oxidase, Protox)는 엽록소/헴 생합성 경로의 핵심적인 효소로 protoporphyrinogen IX (Protogen IX)를 protoporphyrin IX (Proto IX)로 산화시키는데 촉매 역할을 한다. Protox 저해 제초제가 작용하면 Protox의 산물인 Proto IX가 세포질에 축적되며, 이로 인해 광조건에서 막이 과산화되면 세포가 사멸하게 된다. 본 연구에서는 토양 미생물인 Myxococcus xanthus로부터 유래한 protox 유전자를 도입한 제초제내성 벼(Jung et al., 2004)의 포장 재배가 토양 미생물에 미치는 영향을 분석하기 위하여 근권 토양의 화학분석, 토양 미생물 군집밀도 등을 비형질전환 벼인 동진벼 및 추청벼와 비교 조사하였다. 또한 분자생물학적 기술을 이용하여 토양 미생물의 전체 군집변화와 도입 유전자의 이동성을 분석함으로써 환경위해성 연구 및 유전자변형 벼의 위해성평가 가이드라인을 구축하고자 하였다.

토양 미생물(Myxococcus xanthus)에서 유래한 protoporphyrinogen oxidase(protox) 유전자가 도입된 형질전환 벼 (CPPO06), 모본(동진벼)과 참고품종인 추청벼를 표준재배법에 따라 한국생명공학연구원 LMO격리포장에 이앙하고 재배하면서, 영양생장기와 생식생장기 등 생육단계별로 토양 시료를 채취하였다. 토양 시료는 Kim 등(2008)의 방법에 따라 식물체를 뿌리째 뽑아 비 근권 토양을 제거한 토양을 군집밀도 분석에 이용하였으며, 풍건 후 2 ㎜의 표준망체로 거른 토양은 화학성 분석에 이용하였다.

채취한 토양 10 g에 멸균한 0.85% NaCl 90 mL를 첨가하고 진탕 배양기에서 30분간 200 rpm으로 현탁하였다. 현탁액은 일련의 희석과정을 거친 후 28℃ 조건에서 도말하여 세균, 진균 및 방선균을 배양하였으며, 각각 cycloheximide(0.05 g/L)를 첨가한 R2A agar(NA, Difco, MI) 배지에서 2일간, chloramphenicol(0.02%)을 첨가한 R2A agar 배지에서 4일간, Sodium caseinate agar 배지에서 5일간 배양한 후 계수하였다. 배양된 미생물 수는 페트리디쉬에 나타난 균체를 3반복 계수한 평균값을 생균수(colony forming unit, CFU/g건토)로 산출하였다.

형질전환 벼와 비 형질전환 벼를 재배한 토양 미생물 간의 군집 변화를 알아보기 위해 Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) 분석을 하였다. FastDNA Spin Kit(Qbiogen, USA)로 토양 미생물 DNA를 추출하고, 진정세균의 미생물상 변이 여부를 분석하기 위하여 16S rRNA의 V9 부위를 증폭하는 1070f(5'-ATGGCTGTCGTCAGCT-3')와 여분의 G+C clamp(CGCCCGCCGCGCCCCGCGCC CGGCCCGCCGCCCCCGCCCC)가 부가된 1392r(5'-AC GGGCGGTGTGTAC-3') primer를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 각각 5 μL 10 x PCR buffer, 10 ng 주형 DNA, 25 pmol 양방향 프라이머, 200 μM dNTP, 2.5 U f-Taq DNA polymerase(Solgent, Daejeon, Korea)를 첨가한 후 최종 부피를 50 μL로 하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분의 과정을 30번 반복하였으며, 마지막으로 72℃에서 7분간 반응시켰다. PCR 산물은 Dcode Universal Mutation Detection System(Bio-Rad, Hercules, USA)을 사용하여 변성제인 formamide가 40-70%로 농도 구배된 8% acrylamide gel에서 전기영동하였다. 전개된 DNA를 SYBR Green I(Cambrex BioScience, USA)과 EtBr로 염색하여 UV trans-illuminator에서 관찰하였다.

식물뿌리의 존재에 의해 토양 미생물이 영향을 받는 토양내의 공간을 근권이라고 하는데 근권의 토양부분에서 세균을 동정하기 위하여 FastDNA Spin Kit로 DNA를 추출하고, 27mf (5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' ) 와 1492r(5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 세균의 전체 16S rRNA 부위를 증폭하였다. PCR 반응물의 조성과 조건은 미생물 군집 분석 방법과 동일하게 수행하였으며, 1% agarose gel에서 확인된 DNA를 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 삽입하고 E. coli DH5α에 형질전환하여 배양하였다. 형성된 콜로니를 무작위로 선발하여 DNA clean kit(Bioneer, Daejeon, Korea)로 정제하고 우점세균의 동정을 위해서 특이적인 27mf와 519r(5'-ACGG GCGGTGTGTAC-3') primer를 사용하여 삽입 절편을 증폭하였다.

토양 화학분석은 농촌진흥청의 토양 및 식물체 분석법 (NIAST, 2000)에 준하여 형질전환 벼와 비 형질전환 벼의 근권 토양을 음지에서 건조시키고 2 ㎜체를 통과한 토양을 분석하였다. pH와 EC는 토양과 증류수를 1:5로 혼합하여 30분간 진탕한 후 현탁액을 측정하였으며, 유기물 함량은 Walkley와 Black법(Walkley and Black, 1934), 유효인산은 Bray No. 1법(Bray and Kurtz, 1945)으로 각각 분석하였다. 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 나트륨 등 치환성양이온은 1N Ammonium acetate(pH=7.0)로 침출한 후 유도결합플라즈마가 장착된 원자발광분광기(ICP-730-ES)로 분석하였다.

형질전환 벼로부터 근권 주변 미생물로의 수평적 유전자 이동성 여부를 확인하기 위하여 근권 토양에서 DNA를 분리하고 PCR증폭을 통해 토양 내 잔존성을 조사하였다. 도입유전자(protox)를 증폭할 수 있는 primer(Protox F, 5'-ATG CATCACATGCCAAGA-3', R, 5'-CTACCCTACGGTG CATGAGAAGT-3')와 벼의 내재유전자(Actin)를 증폭할 수 있는 primer(Actin F, 5'-ATCTTTGGCCTTGGTAGTTTG-3', R, 5'-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3')를 사용하여(Jung et al., 2004) PCR 반응을 실시하였으며, PCR 반응물의 조성과 조건은 미생물 군집 분석에 이용된 방법과 동일하게 하였다.

Protox 제초제내성 벼 재배가 근권 토양의 미생물상에 미치는 영향을 구명하기 위하여 생육단계에 따른 제초제내성벼(CPPO06)와 비 형질전환 벼(동진벼, 추청벼)의 근권 토양에 대한 세균, 방선균 및 진균의 밀도를 비교 분석하였다 (Table 1). 제초제내성 벼와 비 형질전환 벼에서의 근권 토양유래 세균, 방선균 및 진균의 밀도는 유의성이 없어(P>0.05), 제초제내성 벼 재배에 의한 근권 토양 미생물상의 영향은 비형질전환 벼 재배와 유사할 것으로 추정되었다. 그러나 protox 저해 제초제가 아닌 관행제초제를 처리하여 재배한 제초제내성 벼[CPPO06(C.C)]의 토양 세균 밀도는 생식생장기에 증가하였다(P<0.05). 식물 뿌리에서 배출되는 삼출물은 미생물 군집 및 활성의 변화를 초래하며, 근권 토양 미생물상의 변화는 유기물의 분해와 순환에 영향을 주어(Sharma et al., 2005) 식물의 생육이나 병원균 생장 등에 직⋅간접으로 영향을 끼칠 수 있다(Miethling et al., 2000). 그러나 식물체의 생육상태와 근권 미생물과의 상호작용에 의해 미생물의 군집은 변화될 수 있으며(Kardol and Bezemer, 2006), 생식생장기에 증가된 세균 군집밀도는 수확 이후 안정화되었기 때문에(P>0.05), 군집밀도 증가는 생육시기에 의한 일시적인 변화로 추정되었다. 배양 가능한 미생물에 대한 유전자변형 작물의 영향을 간단하게 분석할 수 있는 평판배양법은 glufosinate 제초제내성 벼와 비 형질전환 벼를 재배한 토양의 미생물 군집 분석에 이용되었으며 본 연구와 유사하게 차이가 없다고 보고하였다(Kim et al., 2008).

[Table 1.] Number of microbial population in the GM and non-GM rice cultivation soil

Number of microbial population in the GM and non-GM rice cultivation soil

제초제내성 벼 재배에 의한 토양 내 우점 미생물의 변화를 확인하기 위하여 근권 토양으로부터 DNA를 분리하고 미생 물의 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 근권 토양에서 동정된 세균들의 분포를 phylum 수준에서 비교한 결과(Table 2), 제초제내성 벼와 비 형질전환 벼의 근권 토양에는 Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes가 우점하는 것으로 나타났다. 대상 작물별 또는 생육시기에 따라 제초제내성 벼와 비 형질전환 벼를 재배한 우점 미생물의 점유율은 다소 차이를 보였지만, 우점종은 유사한 것으로 나타났다. 우점종의 생태적 변화가 명확하게 드러날 정도의 차이를 나타내지 않아 제초제내성 벼 재배에 의한 근권 토양 미생물의 우점종 변화에 대한 영향은 크지 않은 것으로 판단되었다. 동일한 지역에서도 재배되는 품종에 따라 토양 서식 미생물의 미세한 군집 차이에 의해 근권 내에는 서로 다른 미생물이 다양하게 존재할 수 있다(Filion, 2008; Sohn et al., 2010). 전분 조성을 변경한 형질전환 감자(SIBU SI)는 모본(SIBU)과는 근권 미생물 군집의 차이를 보이지 않았으나 다른 종의 비 형질전환 감자 (SOLANA)와는 근권 미생물의 차이가 나타났는데(Filion, 2008) 본 연구에서도 이러한 차이는 동일 지역이라 하더라도 품종에 의한 토양 미생물의 군집 차이에 의해 나타난 결과로 추정되었다.

[Table 2.] Bacteria isolated from the rhizosphere soils cultivated with GM and non-GM rice in the fields

Bacteria isolated from the rhizosphere soils cultivated with GM and non-GM rice in the fields

제초제내성 벼와 비 형질전환 벼를 재배한 토양 DNA를 추출하고 16S rRNA를 특이적으로 증폭하여 DGGE 분석법으로 근권 토양 미생물 군집을 비교하였다(Fig. 1). 제초제내성 벼, 동진벼(모본)와 추청벼(재배종)의 시기별 근권 토양 DGGE profile은 거의 유사하였다. DGGE profile을 기반으로 밴드가 나타난 양상을 분석한 결과, 공시재료인 벼의 종류에 따른 그룹이 형성되기 보다는 토양의 채취 시기에 따라 그룹이 형성되는 것으로 나타나 제초제내성 벼 재배에 의한 토양 미생물 군집의 변화는 거의 일어나지 않을 것으로 추정되었다. Glufosinate 제초제내성 벼 재배토양의 시기별 DGGE 분석(Kim et al., 2008)에서도 유사한 profile 결과가 나타났으며 특정 시기의 밴드 패턴 차이는 시료 채취 지점의 토양 이질성에 기인하는 것으로 추정되었다. 토양 미생물 군집변이에 대한 DGGE 분석은 재배 품종, 시료 채취 시기 및 지역의 토양 이질성 등에 영향을 받을 수 있기 때문에 (Kim et al., 2008), 형질전환 작물에 의한 토양 미생물 군집 비교 연구 시에는 동일한 지역에서 형질전환에 사용된 모본을 반드시 대조구로 사용하여 비교해야 한다.

[Fig. 1.] DGGE of 16S rRNA fragments from GM and non-GM rice cultivation soil. Lanes: GM, protox herbicide tolerant (CPPO06); C, CPPO06(C.C, conventional herbicide treatment); D, Donjinbyeo (control), M, DGGE Marker.

토양 미생물 군집의 변화에 의한 토양 화학성 변화는 상호반응하므로 토양 pH, 유효인산, 전기전도도, 양이온, 전질소, 유기물 함량 등을 분석하여 제초제내성 벼와 비 형질전환 벼재배에 의한 근권 토양의 화학성 변화를 조사하였다(Table 3). 토양 pH는 7.4-7.8로서 우리나라 논 토양의 평균 pH인 5.8(Jung et al., 2001)보다 다소 높았으며 생육 적정범위 (pH 5.5-6.5)보다 다소 높은 것으로 나타났다. 토양 유기물은 토양 비옥도를 판정하는 중요한 지표로 토양 물리성을 개선하고 토양 미생물의 활동을 왕성하게 하는데 본 시험포장의 경우 유기물 함량이 적정범위인 25-30 g/Kg 보다 낮게 나타났다. 유효인산은 논작물 생육 적정범위인 80-120 mg/kg과 유사하거나 다소 높은 것으로 나타났으며, 치환성양이온은 적정범위인 칼륨(0.25-0.30 cmol⁺/kg), 칼슘(5.0-6.0 cmol⁺/kg), 마그네슘(1.5-2.0 cmol⁺/kg)과 비교하였을 때 다소 차이가 있는 것으로 나타났다. Protox 제초제와 관행제초제를 처리한 형질전환 벼의 근권 토양에서의 전질소, 유효인산, 치환성 양이온은 유의한 것으로 나타났다. 이러한 차이는 제초제내성 벼 재배에 따른 변화라기보다는 시험 지역의 토양 환경이 반영된 변화로 짧은 기간내에 조성된 논 포장의 영향으로 추정되었으며, 합리적인 평가를 위해서는 적절한 토양 개량이 필요할 것으로 예상되었다. 본 연구에서는 재배 2년차에 안정화되어 나타나지 않았지만 미세한 토양 환경의 화학성 변화를 정확하게 판단하기 위해서는 작물 생육기간 동안 연속적인 분석을 통한 비교가 필요할 것으로 예상되었다.

[Table 3.] Chemical properties in the rhizosphere soils cultivated with GM and non-GM rice

Chemical properties in the rhizosphere soils cultivated with GM and non-GM rice

형질전환 시 도입된 유전자의 근권 토양 미생물로의 수평적 유전자 이동을 위해서는 우선 충분한 양의 DNA가 토양내에 존재해야만 가능하다. 도입 유전자의 잔존성을 확인하기 위하여 식물체 및 식물체를 재배한 근권 토양으로부터 DNA를 분리하고 도입 유전자를 특이적으로 증폭하는 primer로 PCR을 수행하였다(Fig. 2). 식물체의 PCR 결과, 제초제내성 벼는 도입 유전자와 내재 유전자가 함께 증폭되었지만, 비 형질전환 벼는 내재 유전자 밴드만 검출되었다. 근권 토양 DNA의 내재 유전자 PCR 결과, 생육중기까지는 증폭된 밴드가 검출되지 않다가 생육후기인 9월과 10월 토양 DNA에서 증폭된 밴드가 나타났지만 월동 후 차년도에 채취한 4월 토양 DNA에서는 증폭된 밴드를 검출할 수 없었다. 도입 유전자(protox)는 전체 생육시기에 걸쳐 증폭된 밴드가 나타나지 않아 토양 내 잔존성은 내재 유전자보다 낮을 것으로 예상되어 근권 토양 미생물로의 수평적 유전자 이동 가능성은 희박할 것으로 추정되었다. Widmer 등(1997)은 형질전환체 선발에 이용된 항생제 저항성 nptII 유전자가 담배와 감자의 경우 각각 77일, 137일간 토양 내에 잔존할 수 있다고 보고하였으나, PCR 분석을 통해 토양 내 도입 유전자는 수개월 내에 분해되어 검출할 수 없는 것으로 확인하였다. 작물을 재배하는 토양에서 식물 DNA의 토양 내 잔존성은 핵산 가수분해 효소에 의한 식물 DNA의 분해(Smalla and Gebhard, 1999; Widmer et al., 1997), 토양 내 DNase의 존재(Lorenz et al., 1997) 등에 의하여 비 생물학적 또는 생물학적인 영향을 받는다.

[Fig. 2.] PCR fragments for Actin(A), Protox(B) from GM and non-GM rice cultivation soils. Lanes: M, 100bp DNA marker; P, positive control; 4∼10, April∼October; N, negative control.

본 실험 결과 근권 토양에서 도입 유전자가 일정 기간이후 잔존하지 않고 식물로부터 토양 미생물로의 유전자 전달 빈도는 매우 낮거나 제한적이기 때문에, 현재의 과학기술로 검출할 수 있는 한계 이하로 존재할 것으로 예상되어 Germida와 Dunfield(2004)의 연구 결과와 같이 제초제내성 벼로부터 주변 생물체로의 수평적 유전자 이동 가능성은 매우 희박 할 것으로 추정되었다. 그러나 연작 등으로 유전자변형 벼의 재배가 지속적으로 이루어질 경우 유전자변형 작물로부터 근권 토양 미생물로의 유전자 이동 가능성은 높아질 것으로 예상되기 때문에 추후 장기적인 모니터링을 포함해 지속적인 연구가 이루어져야 할 것으로 예상되었다.