각막은 안구를 보호하는 투명한 무혈관 조직으로1) 세균 감염을 방지하는 생리적 방어기능이 있으나 최근 우리나라 실명 원인조사에 따르면 각막질환에 의한 실명이 점차 증가하고 있는 추세이며2) 그중에서도 감염각막염은 각막의 염증반응과 각막 기질괴사가 진행되어 영구적인 시력 장애를 남길 수 있는 위험한 질환이다3).
각막염은 세균성, virus성, 진균성의 순으로 많이 발생 하며1) 세균에 의한 경우가 모든 미생물 감염의 65~90%를 차지하는 것으로 알려져 있고2) 세균은 Staphylococcus, Pseudomonas aeroginosa, 진균은 Fusarium이 가장 많다1). 이중 각막염을 가장 심하게 일으키는 균은 Staphylococcus aureus이며 피부 상재균으로 있다가 주로 안검결막염을 일으키는 Staphylococcus epidermidis도 어떤 지역에서는 세균 각막염의 가장 많은 부분을 차지하기도 한다4).
각막염은 한의학에서 聚星障, 銀星獨見, 花醫白陷, 凝脂醫 등에 해당하며5) 모두 黑睛의 질병에 해당하고, 聚星障은 黑睛 전면에 걸쳐 다수의 작은 별과 같은 혼탁이 한곳에 군집되어 있는 것6), 銀星獨見은 각막에 하나의 混濁이 있는 것1), 花醫白陷은 黑睛에 생긴 예가 산재된 화판과 같이 그 중심부가 패인 것, 凝脂醫는 화농성 風輪질병의 대표적 질환으로서 黑睛에 생긴 한편의 醫가 凝脂와 유사한 것으로 花醫白陷이나 凝脂醫가 심해지면 黃液上衝이 되며, 이것이 더 심해지면 蟹睛을 형성하게 된다6).
각막염은 조기에 적절한 진단과 치료가 이루어지지 않으면 실명할 경우가 흔히 발생하므로7) 각막염 발생시 효과적인 항생제의 조기 투여가 가장 중요하다8). 각막에는 혈관분포가 없기 때문에1) 약물을 국소 점안하는 것이 약물침투에 용이하며9), 점안시 각막 내 높은 농도를 유지하고, 세균이나 세균에서 나오는 여러 가지 독소와 효소를 씻어내는 효과도 볼 수 있다10). 한의학적으로 점안제는 약물의 자연액을 직접 점안하기도 하였고 혹은 약물을 달이거나 물 속에 담근후에 우러난 물을 여과하여 찌꺼기를 제거한 뒤에 사용했으나, 인체에 대한 독성 및 안정성과 유효성에 대한 실험이 많이 부족하다. 또 농도를 비롯한 약제 가공 방법이 일정하지 않고, 대량생산이 안되며 사용이 번거로워 보편적인 사용이 어려운 실정이다11). 따라서 한방 점안 제의 안정적 활용에 대한 적극적인 연구가 필요하다고 사료된다.
이에 본 연구에서는 각막염을 치료하기 위한 목적으로 약침학회에서 제조된 알코올 수침법을 이용한 제제 중에서 淸熱解毒, 明目하여 目赤腫痛, 羞明, 醫障을 치료하는 웅담12)과 淸熱解毒과 解熱의 효능이 있어 감염성질환을 치 료하는 우황13)의 혼합약침액을 點眼劑로 활용하기 위하여 각막염을 유발하는 6종의 균에 대한 항균력을 검증하기 위하여 억제환(Inhibition zone) 및 최소 성장 억제 농도(MIC) 측정을 시행하였다.
1) 균주 및 사용배지
본 실험에 사용한 균주는 한국생명공학연구원에서 분양받은 것으로,
실험에 사용된 웅담·우황약침액은 대한약침학회에서 다음과 같은 방법에 의하여 제조된 것을 사용하였다.
1) 웅담약침액의 제조
(1) 웅담약침액 추출
웅담을 정량하여 증류수에 하루정도 침전시켜 모두 녹인다.
(2) 90% alcohol 교반과 감압농축
① 웅담 농축액의 양을 측정하여 alcohol 90%((농축액×90)/10)를 첨가하여 magnetic stirrer로 3시간 이상 교반한다.
② decompressor기를 이용하여 추출한다.
③ 자석 교반이 끝나면 둥근 플라스크에 90% alcohol 교반액을 넣고 감압농축한다.
④ 감압농축이 되면 alcohol은 끓는점의 차이에 의한 추출법으로 날아가고, 농축된 웅담만 플라스크에 남는다(온도:65℃, vacuum:15정도 설정, 약 5℃의 냉각수).
(3) 80% alcohol 교반과 감압농축
90% alcohol 감압농축액의 양을 측정하여 alcohol 80%로 조정한 후 3시간 이상 교반한다(예:90% alcohol 감압농축액 200cc+alcohol 800cc). 자석 교반이 끝나면 둥근 플라스크에 80% alcohol 교반액을 넣고 감압농축한다.
(4) 70% alcohol 교반 후 여과
① 80% alcohol 감압농축액의 양을 측정하여 alcohol 70%로 조정한 후 3시간 이상 교반한다(예:80% alcohol 감압농축액 300cc+alcohol 700cc).
② 자석 교반이 끝나면 부후너 깔대기로 여과하여 여액을 감압농축한다
(5) 재감압농축 및 여과
70% alcohol 교반까지 3단계 완료 후 증류수를 넣어서 재감압농축한다.(마지막 단계이므로 caramel 상태가 될때까지 충분히 감압농축한다). 이때 잔여 alcohol이 완전히 휘발될 수 있도록 최대한 감압농축한 후 0.1㎛ 여과지 (whatman, Germany)까지 여과한다.
(6) 예비동결
재감압농축이 완료되면 동결건조기용 플라스크에 나누어 -30℃ 정도에서 예비동결한 후 동결건조기(PVTFD- 10A, ilshin lab, 한국)에서 건조한다(동결 건조된 웅담 분말은 평균적으로 100g 당 60~70g이 얻어진다).
2) 우황약침액의 제조
(1) 우황약침액 추출
우황을 정량하여 막자사발에 넣고 분쇄한 후, 멸균된 D.W를 우황가루가 녹을 만큼 넣어 5시간 정도 교반 후 냉장 침전시켜 상층액을 분리 보관한다(이 과정을 3일정도 반복한다).
(2)번부터 (9)번까지 웅담약침액 제조와 동일하게 시행한다.(동결 건조된 우황 분말은 평균적으로 100g 당 12g이 얻어진다).
3) 웅담 · 우황약침액의 제조
(1) 동결건조
동결건조가 완료된 분말상태의 웅담과 우황을 50:50 비율로 정량하고 0.006g/cc의 농도가 되도록 하여 10cc vial 병에 각각 5cc씩 나누어 동결건조기 chamber에 걸어 -50℃ 에서 20℃에 이르도록 동결건조한다.
(2) 웅담 · 우황용 생리식염수 조제
웅담 · 우황분말과 희석후 pH 7.3 염도 0.9%를 유지 할 수 있는 웅담 · 우황용 생리식염수를 Nacl과 Na3PO4(Sodium phosphate)를 첨가하여 조제한다.
4) 억제환(Inhibition zone) 및 최소 성장 억제 농도(Minimum Inhibition Concentration, MIC) 측정
(1) 접종원의 준비
① 세균과 효모는 -80℃에서 동결보존된 시험균주를 영양배지에서 37℃로 24~48시간 배양하여 소생시킨 후, 이중 한 콜로니를 20㎖의 Tryptic Soy broth로 옮겨 37℃에서 120rpm으로 18~24시간 진탕배양한다.
② 배양 후 OD(Optical Density) 값을 측정하여 각각의 균수를 1~2×108/㎖가 되도록 멸균 생리식염수로 희석하여 접종원으로 사용한다.
③ 곰팡이는 25℃에서 포자가 충분히 생성될 때까지 배양한다.
④ 곰팡이의 포자를 0.2% Tween 80이 첨가된 생리식염수 10㎖로 포집하여 충분히 진탕한 뒤, 현미경으로 관찰하여 포자수가 1~2×108/㎖가 되도록 희석하여 접종원으로 사용한다.
(2) 항균활성 탐색
① 준비된 접종원을 각각의 적정배지에 100㎕씩 접종하여 도말한다.
② 도말된 배지 상에 일정 간격으로 filter disc 혹은 cylinder cup을 올려놓고 3mg/㎖ 농도의 웅담 · 우황 약침액 50㎕(cylinder cup에는 150㎕)를 적하한다.
③ 위의 배지를 조심스럽게 sealing하여 세균과 효모는 37℃에서 1~2일, 곰팡이는 25℃에서 일주일간 배양하여 나타난 억제환의 크기를 측정한다.
④ 최소생육저지 농도를 결정하기 위하여 3mg/㎖ 농도의 웅담 · 우황약침액을 적정비율로 단계적으로 희석하여 1~3의 과정을 반복 실험한다.
⑤ 항균제 효과를 비교하기 위하여 Levofloxacin(5mg) 제제의 점안약 Cravit(제일제약)를 검액과 같은 농도로 실험하였다.
1) Staphylococcus aureus KCTC 1916
웅담 · 우황약침액은 50㎕ 전농도에서 억제효과가 나타나지 않아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 1).
2) Staphylococcus epidermidis KCTC 1917
웅담 · 우황약침액은 50㎕ 전농도에서 억제효과가 나타나지 않아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 2).
3) Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004
웅담 . 우황약침액은 50㎕ 전농도에서 억제효과가 나타나지 않아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 3).
4) Aspergillus niger KCTC 6906
웅담 · 우황약침액은 50㎕ 전농도에서 억제효과가 나타나지 않아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 4).
5) Fusarium oxysporum KCTC 16322
웅담 · 우황약침액은 50㎕ 전농도에서 억제효과가 나타나지 않아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 5).
6) Candida albicans KCTC 7965
웅담 · 우황약침액은 50㎕ 전농도에서 억제효과가 나타나지 않아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 6).
각막은 5층으로 이루어진 조직으로 위쪽으로부터 각막상피, 보우만층, 각막실질, 데스메막, 각막내피 등으로 되어 있으며 안구를 보호하는 방어막의 역할과 동시에 광선을 굴절시켜 망막에 도달시키는 작용을 한다14).
각막에서 염증은 조직손상의 비특이적 결과이며, 염증성 반응을 유발할 수 있는 제일 흔한 두 가지 요인은 미생물감염(세균성, 바이러스성, 진균성)과 다양한 면역학적 상태(과민증, 알러지, 자가면역)이다2).
각막염은 세균, 진균, 바이러스 등으로 발생되며 면역 기능의 저하, 저항력이 떨어진 경우, 피로, 가벼운 외상 특히 콘택트렌즈의 착용으로 인하여 각막표피가 벗겨진 경우에 실질에 침범하여 질환을 유발시킨다. 안통, 유루, 발적 및 충혈, 고도의 시력저하, 수명, 불빛 주위의 무지개 현상이 나타난다14). 특히 각막염이 발생한 후 그 자리에 흉터로 인한 혼탁이 발생하면 시력장애가 나타나며, 이는 실명의 주요 원인 중 하나이다1).
각막궤양의 원인으로는 세균, 바이러스, 진균 등이 있는데, 세균은 Pseudomonas aeruginosa, Strep. pneumoniae, Moraxella, β-hemolytic Streptococcus순이며15), 진균은 Fusarium이 가장 많다. 또한 전세계적으로 지역에 따라 원인균의 차이를 보이고 있는데7) 포도구균의 경우 북미지역에서 가장 흔한 각막궤양의 원인균이며, 계절이 비슷한 우리나라에서도 포도구균에 의한 각막궤양이 가장 흔하게 보고되고 있다. 특히 이전에 헤르페스 각막염이 있었거나 안구건조증, 수포성 각막증, 각막 수술을 받은 경우 그리고 아토피인 경우에 기회감염으로서 포도구균에 의한 각막염이 흔하다. 그람음성균으로서는 녹농균이 가장 흔한 원인균이며 특히 콘택트렌즈와 연관된 각막염인 경우 그러하다.
Staphylococcus aureus는 영미지역에서 가장 흔한 세균각막염 원인균으로16) 흔히 경계가 비교적 명확한 회백색 또는 미색의 간질 침윤으로 나타난다. S. aureus의 경우 S. epidermidis에 의한 각막염보다 각막간질 침윤이 더 심하고 병변주위에 경한 간질부종을 볼 수 있으며 염증이 심해지면 농성화되고 간질 농양 등을 형성하며 드물게는 천공도 일으킨다. 때로는 원발병소 외에 위성병소도 보이며 경도 또는 중등도의 전방염증이 있다2).
Staphylococcus epidermidis는 피부상재균으로 있다가 주로 안검결막염을 일으키지만 세균 각막염 또한 일으키며 특히 각막외상으로 인한 정상적인 각막의 감염에 대한 장벽의 파괴가 있을 때 많이 발생한다. 남자, 나이 60대, 직업 농부에서 호발하며 가을에 많이 발생한다4).
Pseudomonas는 세균각막염의 가장 흔한 원인균으로 알려져 있으며17,18), 주로 정상적인 방어기전이 저하되어 있는 사람, 건강한 사람이 각막 찰과상 후 렌즈를 계속 착용한 경우, 부신피질 홀몬제를 장기간 점안했던 눈의 각막에 오염된 콘택트렌즈 등을 사용한 경우 발생한다19). 녹농균의 감염은 각막의 손상을 전제조건으로 하지만 신생아의 경우 반드시 그러하지는 않다. 진행이 빠른 화농성 간질 침윤과 심한 점액농성 분비물이 보이며, 황색의 응고성 괴사가 염증성 상피부종에 둘러싸인 것이 특징 소견이다2). 일단 발생하면 임상경과의 진행이 매우 빠르고 세균이 분비하는 단백분해효소와 독소에 의한 각막조직의 파괴로 인해 심하면 24시간이내에 각막천공을 일으킬수 있다16). 각막중심부를 중심으로 고리모양의 간질 침윤이 보이기도 하고 전방염증이나 진한 염증성 응고물이 보일 수 있다2). 임상적 치유가 된 후에도 이차적 감염이나 궤양의 재발이 많으므로 각막 상태를 면밀히 관찰하여야 한다12).
진균각막염은 근래에 보고가 증가되는 추세에 있으며, 특히 면역기능이 저하된 사람에서 쉽게 감염을 일으킨다20). 원인균은 Fusarium spp. Aspergillus spp. Candida spp. 순이며 Aspergillus가 세계적으로 가장 흔한 원인균으로 보고되고 있다, 주로 남자에서 발생, 농부, 봄가을에 많이 발생한다5,21). 유병율은 낮으나 경과가 나쁘고 예후가 좋지 않다22).
진균의 역학적 분포는 주로 기후와 큰 연관이 있으며, 전세계적으로 가장 흔히 각막염을 유발하는 진균은 Aspergillus로 알려져 있으며22), 한국에서는 사상성 진균 중 Fusarium, Aspergillus, Candida가 가장 흔한 종으로 보고되었다21).
사상진균에 의한 각막염은 초기에는 미세하거나 거친 과립상의 침윤이 상피과 표층간질에 존재하며, 상피는 융기되고 온전할 경우도 있으나 간혹 궤양이 생길수도 있다21). 각막염이 진행되면 세균각막염과 유사한 각막궤양을 보이게 되며 이에 비해 Candida같은 효모각막염은 가장 자리 경계가 비교적 분명한 황백색의 화농을 가진 난원형 궤양을 흔히 일으켜 S.aureus 혹은 S. pneumoniae와 같은 그람양성 세균각막염과 유사하게 나타날 수 있으므로 감별진단을 위한 이해가 임상적으로 매우 중요하다3,20,21).
진균 각막염은 임상적 징후가 서서히 나타나며 감별진단이 어렵고 각막의 심층부까지 침투된 경우가 많아서 각막 찰과에 의한 균 배양률이 떨어질 뿐만 아니라 항진균제의 치유율도 현저히 낮은 실정으로 세균각막염에 비하여 치료가 매우 힘들다1). 이때문에 각막천공이나 안내염이 발생하여 눈을 희생시켜야 하는 경우가 종종 발생하는 전세계적으로 중요한 실명원인의 하나이다21).
세균각막염 치료의 가장 중요한 요소는 원인균을 규명한 후 감수성 있는 항생제를 선택하여 사용하는 것이다. 조기에 적절한 항생제를 투여하지 못하는 경우 심각한 시력장애나 실명을 초래할 수 있다23). 특히 녹농균성 각막염은 감염성 각막궤양 중 가장 심한 조직파괴를 일으키고 증상 발현후 수일내에 급속히 진행하기 때문에24,25) 빠른 진단과 치료가 요구되며 그 치료는 역시 주로 항생제에 의존한다17). 진균각막염은 세균각막염에 비해 진단과 치료가 힘들고 시력장애와 실명을 초래할 위험이 크기 때문에21) 임상소견에 대한 주위깊은 관찰과 원인균 규명, 적절한 항진균제를 선택하는 것이 필요하다20).
이처럼 안과 영역에서 감염성 질환의 기본적인 치료는 항생제의 투여이다. 세균 감염의 예방 및 치료를 위해 항생제가 사용되고 있으며, 점안하는 방법이 외안부의 감염 치료와 수술 전후 외안부의 세균 억제를 위하여 가장 흔히 사용되고 있다8).
한의학에서는 안질환의 치료에 내복약법과 외용약법을 사용하였는데 외용약법에는 點法, 適法熏法, 洗法, 敷法 등이 있다. 그 중 가장 적절한 외치방법은 點法과 適法이 있으며, 이 중 適法이 현재 사용하기에 가장 적절한 방법으로 소개되고 있다. 適法은 약물을 煎湯하여 藥汁을 만들고 藥液을 澄淸濾過하여 患眼에 滴入하는 방법으로 外治法으로 응용하기에 가장 적합하다. 適法의 활용도는 點法과 동일하여 胞瞼, 兩？, 白睛, 黑睛에 발생한 發赤, 腫脹, 疼痛, 灼熱感 등의 外障眼病과 기타 소수의 瞳神및 안내부 조직의 黃精, 神膏, 視衣, 目系에 발생한 蚊蠅飛舞, 黑花飄蕩, 視？火如彩虹, 視物昏朦, 夜盲, 甚則暴盲 등의 內障眼病에 응용할수 있다11,26).
현재 점안약과 관련된 한의학적 연구로는 이27)의 점안약에 대한 문헌적 고찰 연구에서 황련이 다 빈도로 사용되고 있음을 보고하였으며, 황련과 관련된 실험적 연구로서28-32)의 연구들이 진행되었다. 또한 동의보감에 안병의 외용약으로 사용되는 전탕액과 관련된 연구33)가 진행되었으며 최근에 약침액과 관련된 연구34,35)가 진행되고 있다. 그러나 전탕액은 현재 임상적으로 활용하기게 용이하지 못하기 때문에 이를 보완하기 위하여 사용과 보관이 용이한 약침액과 관련된 연구가 활발하게 진행되고 있는 상황 이다.
이에 본 연구에서는 각막염을 치료하기 위한 목적으로 약침학회에서 제조된 알코올 수침법을 이용한 제제 중에서 한의학 문헌에서 眼病의 外治法에 使用된 약재로 淸熱解毒, 明目하여 目赤腫痛, 羞明, ？障을 치료하는12,36) 웅담과 淸熱解毒과 解熱의 효능이 있어 감염성질환을 치료하는13,36) 우황의 혼합약침액을 點眼劑로 활용하기 위하여 각막염을 일으키는 균에 대하여 항균력을 알아보고자 세균성 각막염을 일으키는 균 중 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa와 진균성 각막염을 일으키는 Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans 균주를 선택하여 각각 항균실험을 하였다. 대조군으로는 현재 강한 항균력으로 양방 임상에서 다용되고 있는 Cravit 점안약37,38)을 설정하여 그 효능을 비교하였다.
항균력실험에서는 세균인 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa 3종에 대해서는 Cravit는 항균효과를 보인 반면, 웅담 · 우황약침액은 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans 6종에 대하여 50㎕ 전농도에서 전혀 항균효과를 나타내지 않았다.
이상의 결과로 보아 웅담 · 우황약침액은 감염성 각막염 유발균 6종에 대하여 항균효과를 보이지 않아 점안약으로 사용하기에는 적절치 않음을 알 수 있다. 따라서 향후 높은 항균효과를 가진 한방점안제의 연구가 더 이루어져야 할 것으로 사료된다.
감염성 각막염을 치료하기 위한 점안제로 웅담 · 우황약침액을 활용하기 위하여 각막염 유발균인 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans에 미치는 항균효과를 알아보기 위하여 억제환 및 최소 성장 억제 농도 측정 시험을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. 웅담 · 우황약침액은 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans에 대하여 50㎕ 전농도에서 억제효과가 나타나지 않았다.
이상의 결과로 보아 웅담 · 우황약침액은 각막염 유발세균 및 진균 6종에 대하여 항균효과가 없다는 것을 알 수 있었다. 따라서 감염성 각막염 치료에 활용할수 있는 높은 향균효과를 가진 한방 점안제에 대한 다각적 연구가 필요할 것으로 사료된다.
