In vertebrates, the vitamin D receptor (VDR), a member of the nuclear receptor superfamily, binds the biologically active ligand 1α,25-(OH)2-vitamin D3 (1,25 D3). Nearly all vertebrates, including Agnatha, possess a VDR with high ligand selectivity for 1,25 D3 and related metabolites. Although a putative ancestral VDR gene is present in the genome of the chordate invertebrate Ciona intestinalis, the functional characteristics of marine invertebrate VDR are still obscure. To elucidate the ascidian Halocynthia roretzi VDR (HrVDR), we cloned full-length HrVDR cDNA and investigated the transcriptional activity of HrVDR in HEK293 cells. HrVDR consists of 1,680 nucleotides (559 amino acids [aa]), including a short N-terminal region (A/B domain; 26 aa), DNA-binding domain (C domain; 72 aa), hinge region (D domain; 272 aa), and C-terminal ligand-binding domain (E domain; 161 aa). The amino acid sequence identity of HrVDR was greatest to that of C. intestinalis VDR (56%). In the luciferase reporter assays, the transcriptional activity of HrVDR was not significantly increased by 1,25 D3, whereas the farnesoid X receptor agonist GW4064 increased the transactivation of HrVDR. These results suggest the presence of a novel ligand for and a distinct ligand-binding domain in ascidian VDR.
비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR, NR1I1)는 리간드에 의해 활성화되는 전사인자인 핵수용체 superfamily에 속한다. 핵수용체는 공활성인자(coactivator) 및 공억제인자(corepressor)와 협동적으로 유전자의 발현을 조절한다. 핵수용체 단백질들은 특징적인 domain 구조를 공유하고 있는데 N-말단부터 부분적인 전사활성을 가진 A/B domain, DNA-binding domain (DBD, C domain), hinge D domain, ligand-binding domain (LBD, E domain) 및 공활성인자/공억제인자 결합 부위이며 전사활성을 나타내는 F domain으로 구성된다. VDR은 다른 핵수용체와 유사하게 레티노이드 X 수용체(retinoid X receptor, RXR)과 이형이량체(heterodimer)를 형성하고 각각의 리간드와 결합한 후 비타민 D 반응 영역(vitamin D responsive element, VDRE, PuGGT/GTCANNNPuGGT/GTCA)에 결합하여 최대한의 전사활성을 나타낸다(Sánchez-Martínez et al., 2006; Koszewski et al., 2010; Landry et al., 2011).
척추동물의 VDR은 콜레스테롤을 전구체로 하며 스테로이드 구조를 공유하는 1α,25-(OH)2-vitamin D3 (calcitriol; 1,25 D3)와 높은 친화력으로 결합하며 칼슘 및 인산염 항상성 조절과 같은 전형적인 calcitriol 효과를 나타낸다(Norman et al., 2002). VDR 유전자들은 포유동물, 조류, 양서류, 파충류, 경골어류 이외에도 무악동물 먹장어(
기능적인 비타민D (1,25 D3)는 자외선B (UVB)에 의해 7-dehydrocholesterol의 광이성질체에 기원을 둔 척추동물 진화 초기에 생체내에서 합성된 호르몬으로 생각되고 있다(Bouillon and Suda, 2014). 또한 1,25 D3는 UVB에 의한 DNA 손상을 예방해 줄 수 있는 해양동물의 효과적인 보호물질로 추정된다(Holick, 2011). 한편, 해양무척추동물 피낭류 유령멍게
본 연구에서는 해양무척추동물 VDR 유전자와 단백질 특성을 규명하기 위하여, 멍게(우렁쉥이,
멍게의 VDR cDNA
>
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Full-length HrVDR를 cloning하기 위해, Magest (http://magest.hgc.jp/) database에 등록되어 있는 VDR partial sequence를 바탕으로
[Table 1.] Oligo primers for polymerase chain reaction
Oligo primers for polymerase chain reaction
Total cDNA를 template로 하여 VDR 5′말단과 3′말단 방향으로 각각, 10X BD advantage 2 PCR buffer 2.5 μL, dNTP mix (10 μM) 0.5 μL, 50X BD advantage 2 polymerase mix 0.5 μL, Universal Primer A Mix (UPM) (10X) 2.5 μL, forward primer (MAhrVDR-F), reverse primer (MAhrVDR-R) (10 μM 각각) 0.5 μL, 5′–RACE CDS Primer A, 3′–RACE CDS Primer A (Clontech Lab) (Table 1)를 사용하여 총 25 μL로 5′ RACE-PCR과 3′ RACE-PCR을 수행하였다. Pre-denaturing step 94℃ 3분, denaturing step 94℃ 30초, annealing step 72℃ 2분 5 cycle 실행한 뒤, 다시 denaturing step 94℃ 30초, annealing step 70℃ 30초, annealing step 68℃ 30초, extension step 72℃ 2분 25 cycle 실시한 다음, post-extension step 72℃ 7분 반응하였다. 총 35 cycle을 각각 실행하고 증폭된 DNA 산물은 1% agarose gel로 전기영동 분석하였다.
증폭된 PCR산물을 pGEM-T easy vector (Promega, Madison, WI, USA)에 삽입하고,
>
Luciferase reporter assay 분석
실험 24시간 전에 분주한 human embryonic kidney 유래의 HEK293 세포(5×104)에 HrVDR, HrRXR, human RXR (hRXR), human steroid receptor coactivator (hSRC1) (Maeng et al., 2012b) 및 전남대학교 이영철 교수님으로부터 제공받 은 human VDR 발현용 vector (hVDR), osteocalcin promoter 유래의 VDRE로 구성된 VDRE-luciferase reporter (VDRE-Luc) (Kim et al., 2009), β-galactosidase 발현용 pRSV-β-gal vector (Maeng et al., 2012a)를 LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)으로 transfection하였다. 3시간 후에 10% FBS와 1% 항생제를 포함하는 배지로 교환하였다. 1α,25-(OH)2-vitamin D3 (1,25 D3), 7-dehydrocholesterol (7DHC), Cholecalciferol (CHOLC), Ergocalciferol (vitamin D2), 25-hydroxyvitamin D3 [25(OH)D3], 6-formylindolo [3,2-b]carbazole (FICZ), fanesoid X receptor agonist (GW4064), benzoic derivative retinoic acid (AM580), 9-cis retinoic acid (9-cis RA) (Sigma-Aldrich)를 EtOH에 희석하여 처리하고 24시간 동안 37℃, CO2 5% incubator에 배양하였다. 세포배양액 중의 EtOH 농도는 0.1%이하로 유지하였다. 24시간후, 1X cell lysis reagent (Promega)을 사용하여 세포를 용해 시키고, 실험군 간의 형질 도입률을 보정하기 위하여 β-galactosidase assay buffer (200 mM sodium phosphate buffer pH 7.3, 2 mM MgCl2, 100 mM β-galactosidase (98%), 1.33 mg/mL O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (OPNG)를 처리하여 흡광도 405 nm에서 β-galactosidase의 활성을 조사하였으며, luciferase assay buffer (1M KH2PO4 pH 7.8, 0.5 M MgCl2, 0.1 M ATP, 10 mM luciferin)와 luminometer (Berthold Co., Wildbad, Germany)를 사용하여 luciferase reporter의 활성도를 측정하였다. HrVDR 벡터의 단백질 발현을 확인하기 위하여 HA-epitope를 인식하는 monoclonal 1차항체(mouse anti-HA, H9658, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), goat 2차항체(anti-mouse IgG-HRP, sc2005, Santa Cruz Biotech., Dallas, TX, USA)를 각각 5,000배 희석하여 상법에 따라 western immunoblot을 실시하였다.
HrVDR을 암호화하고 있는 cDNA 전체 염기서열은 5′ 및 3′ RACE 방법으로 얻은 cDNA 산물을 NCBI ORF Finder와 Conserved Domain Search (CD Search) program, CLUSTAL W 및 MultAlin multiple sequence alignment program을 사용하여 분석하였다.
[Table 2.] Amino acid sequence identities with Halocynthia roretzi VDR, HrVDR
Amino acid sequence identities with Halocynthia roretzi VDR, HrVDR
Luciferase reporter assay를 실시하기에 앞서 HEK293세포에 transfection된 HA-HrVDR 발현벡터가 발현되는지 HA epitope 항체를 이용한 western immunoblot 방법으로 조사하였다. 예상한 바와 같이 약 70 kDa 부근에 HrVDR 단일 밴드로 검출되었고, 동일하게 vehicle vector를 transfection한 세포에서는 밴드가 관찰되지 않았으며 hVDR 도입한 세포에서는 약 60 kDa 부근에 나타났다(Fig. 3A).
VDRE-luc reporter를 이용한 luciferase assay에서는 positive control hVDR을 도입한 HEK293 세포에서만 활성형 비타민 D3 (1,25 D3)에 의해 전사활성이 보였고, 다른 비타민D3 전구체 7DHC, CHOLC, 25(OH)D3 및 식물성 비타민 D2에 의한 활성은 보이지 않았고, HrVDR은 실험에 이용된 모든 리간드에 반응을 나타내지 않았다(Fig. 3B). 척추동물의 VDR은 RXR과 heterodimer를 형성하여 최대한의 전사활성을 나타내며 공활성인자가 관여하기 때문에(Sánchez-Martínez et al., 2006), HrRXR, hRXR 및 hSRC1을 transfection하고 전사활성을 추가적으로 조사하였다. HrVDR/HrRXR, HrVDR/hRXR transfection 세포에 1,25 D3 및 9-cis RA 처리에 의해 변화가 없었지만, 공활성인자 hSRC1의 cotransfection은 전사활성을 유의적으로 증가시켰다(Fig. 3C;
본 연구에서는 멍게 VDR을 암호화하는 full-length cDNA (
VDR 유전자는 인간, 마우스, 닭, 도마뱀,
다른 척추동물의 VDR 단백질의 핵심적인 기능 domain들로 판단되고 있는 DBD 및 LBD 영역에 대하여 HrVDR의 대응 영역과 비교하였을 때, 다소간 아미노산서열의 변이가 높은 수준임을 알 수 있었다. 비록 NCBI Blast 분석 결과 척추동물의 가장 유사한 분자로서 VDR 단백질들이 검색되었지만, 호르몬 결합 부위인 LBD의 변이가 많았고 유사 종
척추동물의 VDR과 현저한 아미노산 변이를 보이는 HrVDR 및