유류 오염지역 및 생태계 또는 토양 침전물에 존재하는(Kim and Lee, 2008) 다환방향족탄화수소(PAHs; Polycyclic aromatic hydrocarbons)는 유해한 물질로서 독성이 매우 강하며 발암성 유발물질로서 인간에게 위험요인이 될 뿐만 아니라 생태계를 파괴시킬 수 있기 때문에 점차 그 관심이 높아지고 있다(Wang
경북 울진군에 소재하고 있는 4곳의 주유소(SK, GS, Hyundai-oil bank, S-oil)에서 상용 휘발유를 1L 구입하였으며 시료로서 사용하였다. PAHs는 naphthalene, phenanthrene, pyrene (각 0.1%, Sigma Chemical Co., USA 순도 98% 이상)을 사용하였다.
울진군에 소재한 봉평, 죽변, 북면 지역의 주유소에서 샘플을 채취한 후 marine고체 (Difco2216) 배지에 100 μL씩 접종 후 도말 하였다. 배지 1 L에 대한 조성은 다음과 같다. peptone 5 g, yeast extract 1 g, ferric citrate 0.1 g, sodium chloride 19.45 g, magnesium chloride 8.8 g, sodium sulfate 3.24 g, calcium chloride 1.8 g, potassium chloride 0.55 g, sodium bicarbonate 0.16 g, strontium chloride 34 mg, boric acid 22 mg, sodium silicate 4 mg, sodium fluoride 2.4 mg, ammonium nitrate 1.6 mg, disodium phosphate 8 mg, agar 15 g이며, 28℃ 배양기에서 약 2주간 배양 하였다. 단일 균주 분리를 위해 3차 분리하여 독립된 개체를 얻었다.
PAHs 분해 활성이 있는 균주 확인을 위해 승화법(Alley and Brown, 2000; Kwon
지질분해 활성분석은 marine (Difco, USA) 배지에 tributyrate (tributyrin, TBN; C4; Sigma, USA) 1%를 첨가하여 배지와 골고루 섞이게 하여 균 접종 시 투명환을 보기 쉽게 하기 위해 sonication을 28~30℃에서 10~30분 하였다. 여기에 agar를 8 g 첨가하여 sonication 후 121℃ 15분간 멸균을 하였다. 지질분해 활성 관찰은 PAHs 분해 활성이 확인 된 균주를 접종하여 28℃에서 5일 동안 진행하였고 투명환을 나타내는 균주를 선별하였다.
단백질분해 활성 분석은 marine 배지에 skim milk(Difco, USA) 를 0.5%와 agar를 8 g 첨가하여 121℃ 15분간 멸균을 한 후 skim milk 배지를 제작했고, 단백질분해 활성 관찰은 skim milk 배지에 PAHs 분해 활성이 확인 된 균주를 접종하여 28℃에서 5일 동안 진행하였고 투명환을 나타내는 균주를 선별하였다.
PAHs 분해 활성이 확인 된 균주를 marine 액체배지에 접종하여 28℃에서 3일간 배양 하였고 원심분리 후 균체를 얻어 생촉매로 사용하였다. 에폭사이드 가수분해 활성 반응은 각 균주의 균체 0.2 g과 4 mM의 라세믹스티렌옥사이드(styrene oxide; Aldrich, USA) 기질을 1 mL의 50 mM 인산완충액(pH 8.0)에 현탁 시킨 후 28℃, 200 rpm에서 교반하면서 반응을 진행하였다. 반응 후 에폭사이드를 hexane으로 추출한 후, 유기용매 층을 Gas Chromatography (GC; Agilent, USA)로 분석하였다. 분석에 사용한 칼럼은 베타-DEX 120 (Supelco, USA; 0.25 mm ID, 30 m length, 25 μm film thickness)을 사용하였으며, Gas Chromatography 조건은 문헌치를 이용하였다(Woo
Chloramphenicol, streptomycin, ticarcillin, kanamycin, tetracycline, ampicillin, vancomycin, rifampin, penicillin, erythromycin 등 10가지의 항생제를 이용하였다. Marine액체 배지에 미리 2일간 배양하여 활성화 시켜 연구에 사용하였다. Marine고체 배지에 4%의 액체배지 배양액을 접종하고 이 고체 배지에 항생제 테스트 디스크(BD, Antimicrobial susceptibility test discs)를 올려 놓으면 내성이 있는 균주는 투명환 형성을 하지 않고 항생제에 대해 내성이 없는 균주는 투명환 형성을 하는 것으로 측정하였으며, 접종 후 28℃에 배양하여 측정하였다.
PAH분해 미생물의 염내성 분석을 위하여 NaCl (0, 2, 5, 10, 15, 20%)함량을 다르게 하고 평판배지에 배양되어 있는 단일 균주를 한 백금이 취하여 액체 배양하여 활성화시켜 사용하였다. 즉, 50 mL의 marine 액체배지에 28℃에서 약 24시간 세균을 배양하여 배양액을 사용하였다. 96 well plate에 배지 180 μL에 배양액을 10 μL를 접종하고 배양하면서 Multiskan Spectrum 600 nm에서 측정하였다(Thermo Electron Corporation, Vantaa, Finland).
상용휘발유로부터 분리된 PAH분해 미생물이 해수에 적용 할 수 있는지 여부를 판단하기 위하여 울진 지역에 위치한 후정 해수욕장 (경북 울진군 죽변면 위치), 망양정 해수욕장 (울진군 근남면 위치) 부근에서 해수를 취하여 여과한 후, 증류수 대신에 해수를 이용하여 marine 배지(Modified-marine medium)를 제조하여 PAH 분해 미생물의 생육분석을 측정하였다. 분리된 균주는 평판배지에 배양되어 있는 단일 균주를 한 백금이 취하여 액체 배양하여 활성화시켜 사용하였다. 즉, 50 mL의 marine 액체배지에 28℃에서 약 24시간 세균을 배양하여 배양액을 사용하였다. 96 well plate에 modified-marine 액체배지 180 μL에 배양액을 10 μL를 접종하고 20℃, 28℃에서 배양하면서 측정하였다. 또한 적은 영양분 함량에서의 균의 배양특성을 측정하기 위하여 modified-marine 액체배지를 수집한 해수로 10-1, 10-2으로 희석하여 균을 접종한 후 배양특성을 조사하였다.
>
상용 휘발유로부터 균 분리 및 PAH 분해 세균 선별
상용 휘발유로부터 102 균주를 분리 하였는데, 분리한 균은 잘 생육되지 않았으며 colony의 발생률이 아주 작았다(Table 1). 약 20개의 plate를 만들 경우 1~2개의 colony가 분리되었고, 여러 종류의 배지(Difco Nutrient agar, Difco Tryptic soy agar, Difco LB agar)를 이용하여 균의 분리를 했으나 marine agar 배지에서 균의 성장이 가장 잘 이루어 졌다. 한편 PAH 분해는 승화법을 이용하였으며 약 200균주 중에 13균주가 PAH 분해 활성을 보였다. PAHs 물질은 낮은 용해도로 인해 환경에 존재하고 있는 탄화수소 분해 세균들도 기질로 이용하기 쉽지 않아 분해 속도가 매우 낮은 것으로 알려져 있다(Hwang and Song, 1999). 또한 많은 연구에 의하면 PAHs 분해 활성이 있지만 저온에서는 생육이 힘들어 분해 활성을 나타내지 못하는 것으로 알려져 있다(Lee
[Table 1.] Bacterial isolation from commercial gasoline
Bacterial isolation from commercial gasoline
PAH 분해력을 보인 13균주를 16S rRNA 유전자를 분석하였다. 13균주중 7균주가
지질분해 활성이 있는 저온성 미생물은 유류사고 시 화학약품을 이용한 유류 제거의 대안방법으로 인위적으로 살포해 친환경적인 환경 정화 방법으로도 이용하고 있다(Seo
[Table 2.] Antibiotics resistance and tributyrin test of PAH-degrading bacteria
Antibiotics resistance and tributyrin test of PAH-degrading bacteria
단백질 분해효소는 전통적으로 식품의 가공과정에서 육질연화와 발효음료 제조과정에서는 혼탁을 방지하고, 제약산업 분야에서는 소화제, 소염진통제로서, 또한 피혁산업, 세제산업 및 환경정화산업 등 여러 산업분야에서 널리 사용되고 있다(Kim, 2014). 단백질분해 활성은 13개의 균주 중에서
에폭사이드 가수분해효소(epoxide hydrolase, EHase) 바이오촉매를 사용하면 라세믹에폭사이드 기질로부터 광학활성 에폭사이드를 제조할 수 있으며, cofactor 재순환이 요구되지 않고, whole-cell biocatalyst로 사용할 수 있으며, 안정된 구조를 가지고 있어 상업적 유용성이 높은 바이오촉매로 평가되고 있다. 광학활성 에폭사이드 제조에 활용할 수 있는 미생물 유래의 에폭사이드 가수분해 활성은 Gas Chormatography를 이용하여 측정할 수 있다(Woo and Lee, 2014). 13개 균주를 대상으로 라세믹스티렌옥사이드와 반응하고 헥산으로 추출을 시킨 후, 에폭사이드가 있는 유기용매층을 Gas Chromatography로 분석한 결과,
PAHs 분해능을 가진 13개 균주를 이용하여 항생제 분석을 하였다. 균 마다 항생제에 대한 내성을 알아보기 위해 측정하였으며 분석 결과
본 연구에서는 균의 증식에 영향을 미치는 인자 중 하나인 식염 함량에 따른 균의 성장변화를 측정하였다. 즉, 96 well plate에 배지 180 μL에 배양액을 10 μL를 접종하고 배양하면서 600 nm에서 O.D.값을 측정하였다. 상용 휘발유에서 분리한 균 중 PAH 분해능이 있는 13개 균주에 대하여 염 내성분석을 하였다. 염 농도는 0, 2, 5, 10, 15, 20%로 조절하였고, 그 결과 13개의 균주가 0-2% 농도에서 O.D.값이 48시간 후에는 0.5 이상으로 균이 잘 자랐으며, 10%의 높은 농도에서는
해양 오염에 대한 유류의 분해 및 적응력을 분석하기 위하여 증류수 대신 채취한 곳이 다른 각각의 해수를 이용하여 실험하였다. 염 농도 및 온도는 탄화수소의 이용에 영향을 미치는데 세균의 경우 30℃에서는 쉽게 성장 할 수 있지만 4℃에서는 이용이 쉽지 않다. 반면 낮은 온도에서
배지농도를 달리하고 채취한 곳이 다른 해수를 첨가하여 세균의 성장 유무를 측정하였으며
Effect of salt concentration and temperature on survival of PAH-degrading bacteria in seawater.
바다 환경의 독성, 수온, pH, 산소 등은 생물정화에 큰 영향을 끼친다. 그 중 수온은 미생물의 활성에 큰 영향을 주며 이러한 이유로 찬 바닷물에서의 유류분해가 따뜻한 바닷물에 비해 어려운 것으로 알려져 있다. 실제로 이러한 이유로 현장 적응에 한계가 있다(Kwon
본 연구는 상용 휘발유로부터 균을 분리하여 PAH의 분해 미생물을 탐색하고 분해 미생물의 특성을 살펴보았다. 그 결과 PAH 분해 활성이 있는 13개의 균주가 분리되었으며 13균주중 7균주가