본 실험에 사용된 Helicosporium sp. KCTC 0635 균주는 1998년 경남 하동의 밤나무 고사목에서 분리되었으며, 균사는 나선모양을 나타내고, 배양적 특징으로는 PDB배지에서 1주간 배양 시 밤색의 색소를 분비한다. 따라서 본 시험 균주는 Helicosporium sp.으로 동정되었다(Choi et al., 2012; Goos, 1987). 분리균의 항균활성은 감자한천배지(PDA)에서 Helicosporium sp. KCTC 0635를 배지가 분주된 plate 한편에 접종하여 25℃에서 5일간 배양한 후 오이 모잘록병원균 (Rhizoctonia solani), 잔디 갈색퍼짐병원균(Rhizoctonia solani AG2-2 IV), 시들음병원균 (Fusarium oxysporium) 및 역병균(Phytopthora dreschsleri)의 균총을 40 mm 거리에 대치배양 하였다. 각 병원균의 최적 배양온도에서 7일간 배양 후 두 균사이의 저지원 크기를 조사하였다. 한 개의 plate를 한 반복으로 3반복 실험하였다.

Helicosporium sp. KCTC 0635 BP 균주는 오이에서 분리된 Rhizoctonia solani와 잔디에서 분리된 Rhizoctonia solani AG2-2 IV 균에 대해서 매우 높은 길항력을 나타내었다(Table 1). R. solani (cucumber)에 대한 저지원은 15 mm, R. solani AG2-2 IV는 12mm 였다. 그러나 오이의 주요 토양전염병균인 Fusarium oxysporium과 Phytophthora dreschsler에 대한 항균활성은 상대적으로 낮거나 없는 것으로 나타났다(Table 1). 공시한 모든 병원균에 대한 coiling 현상은 보이지 않았으며, 균사의 lysis는 Phytophthora dreschsler을 제외한 3종의 병원균에 대하여 보였다.

분리균의 배양액을 얻기 위하여 850 ml 병버섯 재배용 플라스틱 용기에 PDB 500 ml를 넣어 121℃ 1.5기압에서 30분간 멸균하였다. PDA배지에서 7일간 배양한 분리균의 균사절편(직경:10 mm)을 미리 멸균하여 준비한 PDB가 분주된 버섯 재배용기에 접종 후 25℃ 진탕배양기(120 rpm)에서 10일간 배양하여 121℃ 1.5기압에서 30분간 멸균하였다. 멸균 후 킴와이프스로 균사를 제거하여 배양여액(조배양여액)을 얻었다. PDA배지에 배양여액을 1, 5, 10, 20, 50 및 100% 비율로 첨가하여 살균한 다음 9 cm Petri dish에 20 ml씩 분주하였다. PDA배지에서 5일간 배양한 Rhizoctonia solani (cucumber), Rhizoctonia solani AG2-2 IV 및 Fusarium oxysporium 균사절편(직경: 5 mm)을 접종하여 배양 7일 후 균총의 직경을 측정하였다. 처리는 한개의 Petri dish를 한 반복으로 3반복으로 하였다.

Helicosporium sp. KCTC 0635 BP와 식물병원균과의 대치배양 시 길항작용이 매우 높은 것으로 확인되어 Helicosporium sp. KCTC 0635 BP의 배양여액을 농도별로 첨가한 배지에서의 억제효과를 알아본 결과는 Table 2와 같았다. Helicosporium의 배양여액은 식물병원균의 종류와 배양여액의 농도에 따라 억제율에 큰 차이를 보였다. 잔디 갈색퍼짐병균에 대한 억제율이 가장 높게 나타나 배양여액 5% 처리 농도에서도 100%의 억제율을 보였다. 오이 잘록병균에 대한 항균활성은 5% 농도에서 70%이상의 억제율을 보였고, 50% 농도에서는 100%의 억제율을 보였다. 시들음병균에 대해서는 100% 농도에서 66.7%의 억제율을 보여 Rhizoctonia solani에 비해 억제효과가 떨어지는 경향을 보였다.

Helicosporium sp. KCTC 0635BP 균 배양여액의 Rhizoctonia solani AG2-2 IV에 대한 농도별 및 침지시간에 따른 항균효과를 알아보기 위하여 배양여액을 1, 5, 10, 20, 50, 100% 비율로 조절하여 50 ml 삼각플라스커에 20 ml를 넣어 살균하였다. PDA배지에서 배양한 Rhizoctonia solani AG2-2 균사절편(직경: 5 mm)을 1, 4, 8, 24시간 침지시킨 후 살균수로 배양여액을 제거하여 PDA배지(직경 9 cm Petri dish)에 접종하여 25℃항온기에서 배양하여 균총의 직경을 측정하였다. 처리는 한 개의 Petri dish를 한 반복으로 3반복으로 하였다.

Helicosporium sp. KCTC 0635 BP 균주의 배양여액 농도와 침지시간에 따른 잔디 갈색퍼짐병균에 대한 항균효과는 Table 3과 같았다. 침지시간이 길수록 낮은 농도에서도 높은 억제율을 보여 100% 농도에서는 1시간, 50% 농도에서는 3시간, 20% 농도에서는 24시간 침지 시 100%의 억제율을 보였다.

배양여액을 이용한 잔디라지패취병의 방제효과를 알아보기 위하여 5월부터 6월까지 부산의 A골프장 11번홀 들잔디(Zoysia japonica)에 PDB에서 배양한 배양여액을 1배, 10배, 150배, 500배액으로 살포하였다. 처리 전 잔디갈색퍼짐병 병반의 크기를 측정한 후, 병반 가장자리에 4방향으로 표시를 하였고, 처리 7일 후 병반 크기를 측정하였다. 방제효과는 처리 전 발생면적과 처리 후 발생면적을 조사하여 병진전율을 구하였다. 대조약제로는 잔디의 갈색퍼짐병 방제 약제로 등록되어 있는 Pencycuron 25WP를 기준량으로 처리하였다. 실험은 3반복으로 수행하였고, 약제처리 전후 강우는 없었다.

통계처리는 처리 평균간 차이를 Duncan’s multiple range test (P<0.05)로 분산분석하였다.

Helicosporium sp. 배양여액 100%와 10배 처리에서 잔디 갈색퍼짐병에 대하여 100%의 방제가를 나타내어 대조약제와 동일한 효과를 나타내었다(Table 4). 또한 처리 후 지속기간에 있어서도 배양 여액을 처리한 경우에는 30일 후까지도 병진전이 없었으나 농약을 처리한 경우에서는 30일 후 병이 진전되는 것을 관찰할 수 있었다.

Helicosporium의 항균활성에 대한 연구는 매우 제한적이며 1995년 Hardy와 Sivasithamparam에 의해 처음 언급되었다. 본 연구에 사용한 Helicosporium 0635BP 균주의 배양액에서는 2-methylresorcinol의 존재가 확인 되었으며 이물질은 그람 양성균들에 대한 저해활성이 그람 음성균들에 비하여 상대적으로 높게 나타났으며 사람의 폐암 세포주 MCF-7에 대해서도 최소저해농도가 5.4 μg/ml로 낮게 나타났다(Choi et al., 2012). 그러나 Helicosporium 0635BP 균주의 식물병에 대한 영향은 보고 된 바 없으며 본 균주에서 항균력이 있는 물질로 확인 된 2-methylresorcinol이 식물 병원균에 대한 항균 활성은 검토 된 바 없다. 본 연구의 결과 Helicosporium 0635BP 균주는 오이의 모잘록 병균인 Rhizoctonia solani와 잔디의 갈색퍼짐병균 R. solani AG2-2 IV에 대한 균사성장 억제가 역병균이나 시들음병균에 비하여 높게 나타났으며 같은 Rhizoctonia solani중 잔디 갈색퍼짐병에 대한 항균활성이 더 높게 나타났다. 한편 본 균주는 살균한 배양여액이 이들 병원균에 대한 높은 항균활성을 보임으로 인해 활성물질이 열에 매우 안정적인 물질로 추정되며 활성물질이 생균류에 포함 된 것이 아니어서 실용적인 측면에서 유용할 것으로 판단된다. 특히 골프장 들잔디에서 실험 한 결과 10배 희석액에서까지 100%의 방제효과를 보여 항균활성 성분의 동정을 통해 유효성분의 함량을 높인다면 생화학 농약으로 사용 가능성도 충분할 것으로 판단된다. 또한 본 균주의 배양여액은 야외실험에서 잔디에 대하여 약해를 나타내지 않았으며 오이를 대상으로 발아실험과 생육실험을 수행 한 결과도 약해가 없는 것으로 식물체에 안전한 것으로 판명되었다(자료 미제시). 특히 대조약제로 사용한 화학농약에 비하여 30일 이후까지 잔디 갈색퍼짐병에 대한 억제효과가 있는 것으로 나타나 잔디밭에서 화학농약에 비하여 상대적으로 지속성이 높은 것으로 판단 되었다. 또한 부생성이 강하여 일반 배지상에서 다른 길항미생균들에 비하여 쉽게 증식이 되는 특성을 가지고 있어 저가의 배양원 탐색이 수반된다면 배양 비용 절감으로 대량생산을 위한 경제성 확보가 가능 할 것으로 판단된다. 추후 본 균주의 Rhizoctonia solani에 대한 항균물질 분석과 활성력 검정이 필요할 것으로 생각된다.