토양 방선균 유래의 천연 제초활성 후보소재를 발굴하고, 이 후보소재의 온실 및 포장 실증 평가를 통해 보다 친환경적이고 효율적인 잡초 관리를 위한 잡초방제제로의 실용화 가능성을 검토하고자 본 연구를 수행하였다. 3,000여 종의 토양 방선균으로부터 강력하고 독특한 제초활성을 발현하는 후보 방선균 2종을 선발하였으며, 선발된 후보 방선균의 16S rDNA 서열을 분석한 결과 S. scopuliridis RB72와 가장 유사도가 높아 선발 균주를 S. scopuliridis KR-001이라 명명하였다. 후보 방선균의 최적 배양조건을 확립하였고, 온실 및 포장조건에서 주요 문제잡초와 난방제 잡초, 환경 위해 잡초 가시박 방제효과를 평가를 통해 친환경적인 천연물 제초제로서의 개발 가능성을 확인하였다. 한편, 후보 방선균 S. scopuliridis KR-001 배양액은 작물에 대한 선택성은 없었기 때문에 비선택성 경엽처리제로의 개발 가능성을 고려한 처리 농도 및 시기 등에 대한 진전단계 연구를 진행할 필요성이 제기되었다. 향후 배양액 수준에서 제형 연구를 통해 약효증진기술과 대량생산성 기술 개발을 통해 실용화 가능성을 검토하는 한편, 배양액 내의 살초성분에 대한 화학구조 구명을 통해 방선균 유래의 천연 제초제를 개발 할 수 있는 선도물질 발굴을 위한 추가 연구가 필요한 것으로 판단하였다.
With increasing environmental issues from synthetic chemical herbicides, microbe-originated herbicides could be a fascinating alternative in current agriculture. We isolated
오랜 기간 동안 유기합성 제초제는 저렴한 비용과 높은 제초활성 등의 이유로 다양한 종류의 잡초를 제거하기 위해 사용되어 왔다. 하지만 세계적으로 환경에 대한 관심이 높아지면서, 종래에 사용하던 유기합성 제초제를 이용한 잡초관리에 대한 부정적 의식이 증가하는 추세이다. 또한 제초제 연용에 의한 저항성 잡초의 출현 빈도가 늘어나 이를 대체 할 수 있으며 낮은 인축독성과 생분해가 가능하고 선택성이 높은 친환경 제초제에 대한 관심이 커지고 있다(Hoagland, 1990). 특히 미생물이 생산하는 제초활성 물질의 경우 효율이 높고(Duke et al., 1996, Lydon et al., 1999) 환경친화적인 특징을 지녀 연구재료로써 뿐만 아니라 산업적 응용분야에서도 큰 관심을 받고 있다.
미생물 기원의 제초활성 물질은 세균이나 곰팡이, 또는 방선균으로부터 분비되는 생리활성 물질 중 하나로 식물독소(phytotoxin)로 분류된다. 대표적인 미생물 유래의 식물독소 또는 제초활성 물질의 예로 세균으로는
본 연구는 한국생명공학연구원 미생물 자원센터로부터 분양받은 약 3,000 여종의 방선균 배양액을 대상으로 바랭이에 대한 살초활성 평가를 통해 후보 균주를 선발하고 염기서열 분석을 하여 균을 동정하였다. 또한, 주요 문제 잡초와 난방제 잡초에 대한 온실 및 포장조건에서의 제초 활성 평가를 통해 보다 친환경적이며 효율적인 잡초 관리를 위한 천연물 제초제로의 개발 가능성을 검토하였다.
실험에 사용한 방선균은 충청북도 청원군 대청호 주변 산림 토양으로부터 HV한천(Humic acid-Vitamin agar) 배지(0.1% humic acid : dissolved in 0.2N NaOH, 0.05% Na2HPO4, 0.171% KCl, 0.005% MgSO4, 0.001% FeSO4·7H2O, 0.002% CaCO3, 50 ppm cycloheximide, 10 ppm nalidixic acid, thimine-HCl을 비롯한 8종 및 2% agar) (Hayakawa et al., 1987)를 사용하여 분리하였다. 분리한 방선균의 보존을 위한 배양은 Bennett’s medium (1% glucose, 0.1% yeast extract, 0.2% Bacto-peptone, 0.1% beef extract)에서 이루어 졌다(Hesseltine et al. 1954). 또한, 방선균의 제초 활성 평가를 위한 배양은 28∘C에서 GSS 배지(1% soluble starch, 2% glucose, 2.5% soybean meal, 0.1% beef extract, 0.4% yeast extract, 0.2% NaCl, 0.025% K2HPO4 and 0.2% CaCO3)를 이용하였다(Kim et al., 1989).
방선균 유전체는 Qiagen사의 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라 순수분리하였는데, 5 mL Bennett’s media 에서 1일 배양한 세균을 1.5 mL 튜브로 옮겨 원심분리하여 상징액을 제거하였다. 남아 있는 세균 덩어리를 enzymatic lysis buffer (20 mg mL-1 lysozyme, 2 mM EDTA, 1.2% Triton X-100, and 20 mM Tris-Cl, pH 8) 180 μl에 현탁하여 37°C에서 1시간동안 방치한 뒤 제조사에서 제공하는 AL buffer에 proteinase K를 첨가하고 56°C에서 30분간 반응시켰다. 이 후 200 μl의 에탄올을 첨가하고 키트에 포함된 컬럼을 이용하여 순수 분리하였다. 최종적으로 분리된 DNA는 AE(제조사 제공) buffer에 용리(elution)하여 냉장 보관하였다.
방선균 유전체로부터 16S rRNA를 암호화하는 유전자를 PCR로 얻어낸 뒤 서열분석을 하고((주)제노텍, 대전, 대한민국), 밝혀진 유전자 서열은 BLAST를 통해 NCBI의 데이터베이스의 염기서열과 비교하였다. 염기서열 비교결과로 얻은 후보군 중에서 유사도가 높은 후보군 20종의 서열을 clustal w (1.6)를 이용하여 정렬하고, 유사도가 매우 높은 부분을 제외한 나머지 서열을 트리밍한 뒤, Neighbour-Joining method (PHYDIT program version 3.0)을 통해 phylogenetic tree를 작성하였다.
방선균 배양액의 살초력을 평가하기 위하여 원예용 상토를 충진한 350 cm2 사각 플라스틱 폿트에 바랭이를 포함한 화본과 잡초 5종과 까마중을 포함한 광엽 잡초 5종을 파종하여 온실(30/20±5°C, Light/Dark=14/10h)에서 토양처리용은 1일, 경엽처리용은 12일 동안 생육시켰다. 이때, 토양처리는 원예용 복합비료가 첨가된 사질 양토를 사용하였다. Bennett’s media에서 1주일간 배양한 방선균 배양액(Tween-20®, 0.1%)을 폿트당 14 ml량으로 분무처리하고 동일한 온실에서 관리 후 토양처리는 14일, 경엽처리는 7일 후에 외형적인 증상 및 약효를 기준표에 의해 달관조사(0; 효과 없음, 100; 완전고사)하였다.
상기 배양조건에서 배양한 S.
용매 분획의 살초력을 평가하기 위하여 표면적 38.5 cm2 polystyrene 컵에 원예용 상토를 충진한 후 바랭이 종자를 10~15립씩 파종하여 온실에서 관리하다가 파종 9일 후에 각 용매 분획 농축물을 약제 조제액(아세톤 50%, 0.1% Tween-20®)으로 8, 16, 32, 63, 125, 250 및 500 μg ml-1 농도가 되도록 희석 조제하여 폿트당 5 ml씩 처리하였다. 처리 5일 후에 약효 기준표에 의해 살초력 정도를 달관 조사하였다.
용매 분획물 중 에틸아세테트 분획물에서 바랭이에 대한 살초력이 가장 우수하였으므로, 에틸아세테트 분획물의 토양 및 경엽처리 효과를 평가하였다. 배양액의 살초활성 평가방법과 동일하게 주요 잡초를 파종하고 온실조건에서 1일(토양처리)과 9일(경엽처리) 동안 생육시킨 후, 에틸아세테트 분획물을 약제 조제액으로 62.5, 125, 250, 500, 1,000 및 2,000 μg ml-1 농도가 되도록 희석 하여 폿트당 14 ml씩 처리하였다. 토양처리는 14일, 경엽처리는 7일 후에 약효 기준표에 의해 달관 조사하였다.
온실조건에서 주요 잡초에 대한 살초력을 확인한 에틸아세테트 분획물의 적용확대 평가를 위해 2011년 10월 중하순경에 대전광역시 유성구 지역에서 환삼덩굴, 쑥, 쇠뜨기, 클로버가 자생하고 있는 지점을 선정하여 수행하였다. 처리 구획은 1×1m로 하였으며, 에틸아세테트 분획물의 최종 처리농도가 2,000 및 4,000 μg ml-1가 되도록 조제하여 처리구당 200ml씩 분무 처리하였다. 처리 후 환삼덩굴은 5, 10, 15일후, 쑥과 쇠뜨기는 5, 8, 10일 후, 클로버는 4, 8, 12일 후에 육안으로 살초효과를 달관 조사하였다.
최근 환경부가 환경위해잡초로 지정할 정도로 심각한 문제가 되고 있는 가시박에 대한 에틸아세테트 분획물의 방제효과를 온실 및 포장조건에서 평가하였다. 온실조건에서 3엽기까지 생육시킨 가시박에 에틸아세테트 분획물 을 약제 조제액으로 최종처리 농도가 1,000 및 2,000 μg ml-1 이 되도록 조제하여 폿트 당 10 ml씩 처리하여 7일 후 에 방제효과 정도를 달관 조사하였다. 한편, 포장조건에서 의 가시박 방제력을 확인하기 위해 경기도 양평군 앙덕리 남한강변 주변에 가시박이 자연 발생된 지점을 선정하여 1×1m로 구획하여 에틸아세테트 분획물을 1,000 및 2,000 μg ml-1 농도로 처리하여 5, 8, 14일 후에 달관 조사하였다. 이 때, 가시박의 생육정도는 12~16엽기이었으며, 전장의 길이 는 약 2~3 m 내외였다.
에틸아세테트 분획물의 주요 작물에 대한 약해 정도를 평가하였다. 대상작물은 벼, 밀, 보리 등 화본과 작물 3종과 고추 및 토마토 등 광엽작물 2종이었으며, 처리 당시 각 작물의 생육상황은 벼 3.5엽, 밀 1.2엽, 보리 1엽, 고추 7.3엽, 토마토 4.4엽이었다. 처리농도는 125, 250, 500, 1,000, 2,000 및 4,000 μg ml-1이었고, 처리 14일 후에 약해 정도를 육안으로 달관 조사하였다.
한국생명공학연구원으로부터 약 3,000여 종의 토양 방선균 배양액을 분양받아 바랭이(
Herbicidal activity of pre and post-emergence treatment of two Streptomyces species to several weeds in a greenhouse condition.
방선균은 의약용 항생제를 비롯하여 다양하고 유용한 생리활성물질을 생성하는데,
강력한 제초활성을 발현하는 2종 후보 방선균의 최적배양 조건을 확립하였고, 최적 배양조건에서의 살초력 정도를 평가하였다. 두 균주의 최적 배양조건은 배양온도 28°C, pH 7, 배양기간은 4-6일로 일반적인 방선균의 배양조건과 비슷하였으며, 이렇게 확립한 최적 배양조건에서 배양한 배양액의 바랭이에 대한 살초력도 가장 우수하였다(Fig. 1A and B).
강력한 살초력을 발현하는 두 균주 동정을 위해 16SrDNA의 유전자 서열 약 1.4 kb를 확보하여 이 전체 서열을 BLAST를 통해 NCBI 데이터베이스와 비교한 결과 두균주 모두
가장 유사한 모델 균주인
처리방법에 따른 살초활성의 특징을 살펴 보기 위해 에틸아세테트 분획물을 토양 및 경엽처리로 구분하여 10종(까마중, 어저귀, 자귀풀, 도꼬마리, 메꽃, 미국개기장, 돌피, 수수, 바랭이, 개밀)의 잡초를 대상으로 활성 정도를 비교하였다.
Herbicidal activity of foliar application of ethyl acetate fraction from Streptomyces scopuliridis KR-001 culture broth to troublesome weeds in semi-field condition.
Herbicidal activity of foliar application of ethyl acetate fraction against Sciyos angulatus in natural habitat.
Effect of ethyl acetate of fraction from Streptomyces scopuliridis KR-001 culture broth on crops in a greenhouse condition.