살치속(Genus Hemiculter)은 강준치아과(Subfamily Cultrinae)에 속하는 어류로서 한국, 중국, 대만, 러시아, 베트남 등지에 분포하며, 우리나라에서는 Hemiculter leucisculus (살치)와 H. eigenmanni (치리), 2종이 서식한다고 알려져 있다(Kim et al., 2005). 이들 두 종의 어류 가운데 H. leucisculus (Basilewsky, 1855)는 한강과 임진강을 비롯하여 북한, 중국 및 대만 등에 분포하고, H. eigenmanni (Jordan and Metz, 1913)는 우리나라 고유종으로 금강의 남쪽에 위치하면서 서해와 남해로 흐르는 하천 및 거제도 등지에 분포하여 분포지역에 있어서 뚜렷한 차이를 보인다(Kim and Lee, 1986). 또한 이들은 복부 융기연이 시작되는 위치나 측선비늘수와 새파수에 있어서도 형태적인 차이를 보이고 있다. 즉 H. leucisculus는 복부 융기연이 가슴지느러미 기저 후방보다 더 뒤쪽에서 시작하며, 측선비늘수는 43-50개, 새파수는 26-32개를 가지는 반면, H. eigenmanni는 복부 융기연이 가슴지느러미 기저 사이에서 시작하며, 측선비늘수가 50-58개, 새파수는 17-21개를 갖는다(Kim and Lee, 1986). 그러나 중국의 상해(Shanghai), 북경부근(Chihli), 양쯔강(Yangtze river)에서 채집된 H. leucisculus의 경우 측선 비늘수가 50-53개를 나타냄으로써(Nichols, 1943) 우리나라에 서식하는 H. eigenmanni의 측선비늘수와 유사하여 H. leucisculus와 H. eigenmanni의 분류학적 관계에 대한 연구의 필요성이 대두되었다.
이와 관련하여 최근 Cho et al. (2012)는 중국의 H. leucisculus의 총모식(syntype)과 한국의 H. eigenmanni 완모식(holotype)표본을 이용하여 형태학적 분석을 수행하였다. 이 결과, H. eigenmanni는 중국 양쯔강에서 채집된 H. leucisculus 총모식 표본과 형태적 차이 정도가 종 내의 변이수준을 보여 이들 두 종을 동종이명으로 보고하였으며, 한국산 H. leucisculus는 아가미 새파수에서 H. eigenmanni와 명확히 구분되기 때문에 추후 검토가 필요하다고 보고한 바 있다. 한편, Bogutskaya et al. (2008)는 사진만을 근거로 형태적인 분석 없이 한국산 H. leucisculus가 H. bleekeri와 동일종일 것으로 추정 보고했을 뿐 이와 관련한 추가적인 연구는 수행하지 않았다.
따라서 이 연구는 우리나라의 여러 수계에서 채집된 Hemiculter속 어류의 cytochrome b 유전자 염기서열과 기존에 NCBI에 등록되어 있는 중국산 H. leucisculus, H. bleekeri (Wrpachowski, 1887) 및 H. krempfi (Pellegrin and Chevey, 1938)의 동일유전자 염기서열 자료를 이용하여 한국과 중국에 분포하는 H. leucisculus와 한국 고유종으로 알려진 H. eigenmanni의 분자계통분류학적 관계와 채집지역을 달리한 개체들 간의 유전적 차이를 규명하고 이를 통해서 우리나라에 분포하는 치리의 기원을 알아보고자 하였으며, H. leucisculus와 H. eigenmanni의 형태분류학적 위치를 분자계통분류학적인 방법을 통하여 검증하고자 실시하였다.
한국산 Hemiculter속 어류의 분자계통분류학적 관계를 조사하기 위해 H. leucisculus (살치)는 파주에서 5마리를 채집하였고, H. eigenmanni (치리)는 경기도 양평, 충북 충주, 충남 서천, 전북 군산, 전남 함평 및 경남 산청에서 총 21마리를 채집하였다. 그리고 중국산 H. leucisculus (AY089709-18), H. bleekeri (KF029693), H. krempfi (KF029694)의 유전자 서열은 NCBI database에 등록된 염기서열 자료를 이용하였다. 참조분류군 (outgroup)은 잉어과 어류의 계통수 작성을 통하여 같은 아과에 속하면서 분류학적으로 연구대상 분류군에 가까운 백조어 (Culter brevicauda)와 강준치(Erythroculter erythropterus)를 선정하여 이용하였다. 연구에 사용한 어류들의 채집위치는 Fig. 1에 나타내었으며, 이들의 학명, 채집지역과 개체수, GenBank Accession No.는 Table 1에 나타내었다.
Total DNA 추출은 시료로부터 25-50 mg의 간, 기저 근육조직이나 지느러미로부터 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Inc.)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭은 Glu-F3 (5'-ACC ACC GTT GT(A/T/C) (A/T/G/C)TT CAA CTA-3')와 Pro-R (5'-TAG AAT (T/C)(T/C)T (G/A)GC TTT GGG AG-3')을 사용하여 미토콘드리아 cytochrome b 유전자 전체를 PCR 증폭하였다(Kim and Song, 2011). PCR 반응 주기는 최초의 denaturing step을 위하여 94℃에서 2분 동안 1회 반응시키고, 이어서 94℃에서 45초, primer annealing을 위해 43℃에서 1분, primer extension을 위해 72℃에서 1분 30초의 반응 조건에서 총 30회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 7분 동안 마지막 extension을 실시하였다. PCR 산물은 Gel Extraction Kit (Takara Bio Inc., Japan)을 이용하여 정제한 후 pBluescript II SK(-) (Stratagene Co.) 벡터에 삽입하였다. Sequencing 반응은 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems)을 이용하여 Peltier Thermal Cycler (PTC-225. MJ Research Inc.)에서 수행되었으며, 염기서열결정 시에는 T3와 T7 primer를 사용하였다.
이를 통해 얻은 자료는 DNAssist (version 2.2) 프로그램을 이용하여 다중 정렬하였다. 염기조성과 각 개체군 내 또는 개체군 사이의 유전자 차이는 MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011) 프로그램으로 계산되었다. 계통수는 neighbor joining (NJ)와 maximum parsimony (MP) 및 maximum-likelihood (ML) 방법을 이용하였다. NJ 계통수 작성은 MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011)를 사용하였고 MP와 ML 계통수는 PAUP version 4.0b8 (Swofford, 1998)을 사용하여 작성되었다. NJ 계통수는 Kimura-two-parameter 진화모델을 사용하였고 ML 방법을 이용한 분석은 MODELTEST Version 3.06 (Posada and Crandall, 1998) 사용하여 분석 자료에 가장 적합한 진화모델을 선택한 후 실시하였다. 그리고 MP 방법에 의한 분석 시에는 heuristic search 방법으로 사용하였다. NJ 방법과 MP 방법으로 작성된 계통수의 internal node에 대한 신뢰성을 확인하기 위하여 10,000회의 bootstrapping (Felsenstein, 1985)을 실시하였다. ML 방법에 의한 분석 시 likelihood 조건들은 MODELTEST 결과에서 얻은 자료들을 사용하였다. 즉 염기조성(base composition) 은 A=0.2546, C=0.2916, G=0.1541, T=0.2597을 사용하였으며, estimated transition/transversion 비율 11.5309과 함께 HKY+G 진화모델을 사용하여 실시하였다.
한국산 Hemiculter속 어류의 형태형질의 특징을 알아보기 위해서 Hemiculter leucisculus (살치) 5마리와 H. eigenmanni (치리) 21마리를 대상으로 등지느러미, 가슴지느러미, 배지느러미, 뒷지느러미의 극조수와 연조수 그리고 새파수를 계수하여 이전 문헌과 비교하였으며, 계측과 계수 방법은 Hubbs and Lagler (2004) 방법을 따랐다.
Hemiculter속 어류의 분자계통분류학적 관계를 알아보기 위하여 연구대상 어류의 mitochondrial DNA에 위치하는 cytochrome b 유전자 전체 염기 서열을 다중 정렬한 후 분석하였다. 그 결과 cytochrome b 유전자는 일반적인 척추동물에서의 유전자 순서인 tRNAGlu-Cytb-tRNAThr-tRNAPro와 동일하였고 ATG 개시코돈(start codon)으로 시작하여 종결코돈(stop codon)으로 예상되는 마지막 염기(T)를 포함하여 1,141 bp였다. 마지막 염기 T을 제외한 1,140 bp의 염기서열은 944군데의 conserved site와 196군데의 variable site로 구성되었다. Variable site는 144개의 parsimony informative site를 포함하고 있었다. Mitochondrial cytochrome b 유전자의 염기조성은 G가 15.5%로 상대적으로 낮았으며, 나머지 T, C 및 A의 염기조성 (T: 27.7%, C: 28.4%, A: 28.4%)은 비슷한 양상을 보였다. 그리고 첫 번째와 두 번째, 세 번째 코돈 위치에서의 transversion에 대한 transition의 비율은 각각 4.0, 0, 13.2를 나타내어 위치에 따라 차이를 보였다.
H. eigenmanni, H. leucisculus, H. bleekeri 및 H. krempfi의 지역 개체간의 유전적인 차이를 p-distance와 염기서열 갯수로 나타낸 결과는 Table 2와 같다. 한국산 H. eigenmanni 지역 개체 사이의 염기서열 차이는 0-3 bp (p-distance=0.000-0.003)로써 채집지역을 달리하는 개체 사이에 뚜렷한 유전적인 차이를 보이지 않았다. 또한 한국산 H. eigenmanni와 한국산 H. leucisculus 개체군간의 염기서열 차이는 104-109 bp (p-distance= 0.091-0.096)를 보였다. 채집지역을 달리하는 중국산 H. leucisculus의 지역 개체 사이의 염기서열 차이는 0-71 bp였고 p-distance는 0.000-0.071였다. 계통수에서 그룹 1을 구성하는 중국의 Qiantangjiang river, Lingjiang river, Yangtze river, Jiulongjiang river 및 Minjiang river에 서식하는 H. lecucisculus 개체 사이의 염기서열 차이는 0-10 bp였고 p-distance는 0.000-0.009였다. 그런데 이들 개체들과 한국산 H. eigenmanni 지역 개체들의 염기서열 차이가 7-11 bp (p-distance=0.006-0.010)를 나타냄으로써 염기서열 차이가 매우 적은 반면에 한국산 H. leucisculus의 지역 개체들과의 염기서열 차이는 102-108 bp (p-distance=0.083-0.095)로써 확연한 차이를 보였다. 계통수에서 그룹 2를 구성하는 Nanliujiang, Zhujiang, Wanquanhe, Qinjiang river 및 Nandujiang에 서식하는 중국산 H. leucisculus 개체들 사이의 염기서열 차이는 0-14 bp였고 p-distance는 0.000-0.012였다. 이들 지역 개체군과 그룹 1을 구성하는 중국 5개 지역에서 채집된 개체들 간의 염기서열 차이는 66-71 bp였고 p-distance는 0.058-0.062였다. 그리고 채집지역을 달리하여 채집된, 우리가 살치라고 부르는 한국산 H. leucisculus 개체들은 그룹 1에 속하는 중국산 H. leucisculus 개체군에 대해 102-108 bp (p-distance=0.091-0.095) 차이를, 그룹 2에 속하는 개체군에 대해 92-99 bp (p-distance=0.081-0.087)의 차이를 나타내는 반면, H. bleekeri와의 염기서열 차이가 6-8 bp (p-distance= 0.005-0.007)를 나타냄으로써 유전학적인 면에서 종내 변이 수준으로 아주 낮았다.
NJ, MP 및 ML 방법을 이용하여 Hemiculter속 어류의 계통수를 작성하였으며 작성된 계통수는 Fig. 2에 나타내었다. 세 가지 서로 다른 방법을 이용하여 작성된 계통수는 모두 동일한 계통수 분지양상(tree topology)을 나타내었다. 작성된 계통수에서 한국산 H. eigenmanni 개체군은 한국산 H. leucisculus 개체군과 계통분류학적인 위치에서 명확한 차이를 나타낸 반면(Fig. 2), 지금까지 H. eigenmanni의 서식지로 알려진 군산, 함평(영산강), 서천(금강) 및 산청(낙동강) 지역뿐만 아니라 이전에 보고되지 않았던 양평, 충주(한강수계)에서 채집된 H. eigenmanni 지역개체들이 서로 매우 가깝게 묶여서 계통학적 차이는 거의 없었다. 계통수에서 중국산 H. leucisculus는 크게 두 개의 지역 개체군 집단, 그룹 1과 그룹 2로 나뉘어졌으며, 특히 중국의 양쯔강과 그 주변 지역(Lingjiang river, Yangtze river, Jiulongjiang river, Qiantangjiang river 및 Minjiang river)에 서식하는 중국산 H. leucisculus는 한국산 H. eigenmanni 개체군과 가깝게 묶여서 계통수 상에서 하나의 개체군 집단(그룹 I)을 구성하였다. 한편 한국산 H. leucisculus 개체군은 중국산 H. leucisculus와 계통분류학적으로 명확한 차이를 보이는 반면, H. bleekeri에 매우 가깝게 묶여 분자계통분류학적으로 동일종으로 인식되었다.
한국산 Hemiculter속 어류의 형태형질의 종간 차이와 종내의 지역 개체군간의 차이, 그리고 개체변이를 알아보기 위해서 한국산 Hemiculter속 어류의 계수형질을 측정하여 이전 문헌과 비교하였다(Table 3). 그 결과, 비록 각각의 지느러미 극·연조수에서는 명확한 차이를 보이지 않았으나 산청, 함평, 양평, 서천, 군산 및 충주에서 채집된 총 21마리의 어류들은 측선비늘수 47-56개, 새파수 17-22개를 보이는 반면에, 파주에서 채집된 5마리의 어류는 측선비늘수 42-49개, 새파수 28-31개로 나타나서, 특히 새파수에 있어서 분명한 차이를 보였다. 따라서 기존에 알려져 있는 한국산 살치속 어류의 분류(Kim and Lee, 1986)에 의하면 형태적 특징에서 파주에서 채집된 개체는 H. leucisculus로, 그리고 그 외 지역에서 채집된 모든 개체들은 H. eigenmanni로 동정, 인식되어왔지만, 이들 두 종의 분류학적 위치 및 학명의 사용에 대해서는 고찰에서 다루고 있다.
미토콘드리아 cytochrome b 유전자를 이용한 지역 개체군의 유전적 차이에 관한 연구는 많은 연구자들에 의해 수행되어 왔으며, 우리나라에서도 일부 어종을 대상으로 수행되었다. 예를들면 우리나라의 서로 다른 수계에 서식하는 꺽지(Coreoperca herzi)는 최대 6.9-12.1%의 염기서열 차이가 있다고 보고한 바있으며(Kim, 2004), 자가사리(Liobagrus mediadiposalis)의 지역 개체군 집단 간에는 4.4-5.7%의 염기서열 차이를 나타내었다(Kim et al., 2006). 후자의 경우 자가사리의 섬진강 개체군은 최근에 신종으로 보고된 바 있다(Park and Kim, 2010). 그리고 쉬리(Coreoleuciscus splendidus)는 우리나라 6개 지역 개체군 간에 0.1-1.8%의 염기서열 차이를 보였으며(Song and Park, 2006), 한국산 쏘가리(Siniperca scherzeri)는 0-0.64%의 차이를 보여 위에서 언급한 어류에 비해 지역 개체군 간에 상대적으로 작은 염기서열 차이를 갖는다(Kim and Song, 2011). 한편, 이 연구에서 한국산 H. eigenmanni (치리)는 6개 지역에서 유래된 지역 개체들 간에 0-0.3%의 염기서열 차이를 나타내어 지역개체들 간의 뚜렷한 차이는 없었다. 상대적으로 작은 염기서열 차이는 앞에서 언급한 한국산 쏘가리의 지역 개체군간의 차이와 유사하였으며, 한국산 H. eigenmanni의 분화역사가 상대적으로 짧은 것을 반영하는 것으로 생각된다.
어류의 분화시기를 추정하기 위하여 여러 연구자들은 분자시계(molecular clock)의 개념을 도입하여 잉어과 어류의 분화시간을 계산하였다(Sasaki et al., 2007; Zardoya and Doadrio, 1999). Zardoya and Doadrio (1999)는 잉어목 어류의 cytochrome b 유전자 염기서열을 이용한 연구에서 이 유전자의 진화속도를 백만 년 당 0.76%로 추정한 바 있다. 이를 토대로 분화시기를 계산하면 한국산 H. leucisculus (살치)와 H. eigenmanni (치리)의 분화는 약 1,200만년 전에 이루어진 것으로 추정되며, 이 시기는 Miocene 중기에 해당된다. 그리고 한국산 H. eigenmanni 지역 개체군을 포함한 그룹 1과 그룹 2사이에는 염기서열 차이가 5.7-6.2%이기 때문에 이 그룹간의 분화 시기는 대략 750만년에서 800만년 전으로 Miocene 말기로 추정된다. 그룹 1 내에서 한국산 H. eigenmanni 지역개체군은 양쯔강 및 그 주변지역에 분포하는 중국산 H. leucisculus 지역 개체군과 0.6-1.0% 염기서열 차이를 보였으며 이를 바탕으로 대략 80만년부터 130만년 전에 분화된 것으로 추정되며 이 시기는 신생대 제 4기 pleistocene의 초기 빙하기로써 한반도와 중국대륙이 하천으로 연결됨으로써 중국의 양쯔강을 포함하는 주변 서식지로부터 중국산 H. leucisculus (한국산 치리와 동일종)의 분포지역이 확장되면서 우리나라로 유입된 것으로 생각된다.
한국산 H. leucisculus (살치)와 H. eigenmanni (치리)의 형태적인 차이는 측선비늘수와 새파수로 구분된다고 보고된 바 있다(Kim and Lee, 1986). 이 연구에서도 이전의 형태 연구 결과와 큰 차이가 없었으나 H. eigenmanni의 측선비늘수가 47-56개로, H. leucisculus의 42-49개 보다 많았지만 범위에서 서로 중첩되어 이를 이용한 명확한 종의 구분은 어려웠다. 하지만 새파수를 이용할 경우에는 이 두 종을 명확히 구분할 수 있었다(Table 3).
중국 양쯔강에서 채집된 H. leucisculus의 총모식(syntype) 표본과 한국의 수원에서 채집된 H. eigenmanni 완모식(holotype)표본을 이용하여 형태학적 비교분석을 수행한 결과, 이들 표본사이에서 형태적인 차이가 없어 동일종이라고 보고하였으며(Cho et al., 2012), 우리의 연구 결과 형태학적 뿐만 아니라 분자계통분류학적으로도 Cho et al. (2012)의 결과를 뒷받침 해주었다. 그러나 중국 남부 H. leucisculus 개체군은 양쯔강 및 그 주변에 서식하는 H. leucisculus 개체군과 염기서열에 있어서 5.8-6.2%로 상당한 차이를 보이고 있기 때문에 이들 어류의 보다 세밀한 형태적 또는 유전학적 연구가 필요할 것으로 생각된다. 그리고 한국산 H. leucisculus는 계통수에서 중국산 H. leucisculus 개체군과 묶이지 않고 H. bleekeri와 아주 가깝게 묶였을 뿐만 아니라 염기서열에 있어서도 종내 수준인 0.5-0.7%의 유전적 차이를 보여 동일종으로 인식되었다. 또한 Bogutskaya et al. (2008)은 형태의 비교분석 없이 비록 사진에 근거하였지만 한국산 H. leucisculus가 외부형태적으로 H. bleekeri와 매우 유사하여 동일종으로 추정한 바 있다. 따라서 한국산 H. leucisculus의 분류학적인 위치를 명확히 하기 위해서 모식표본(type specimen)을 대상으로 보다 세밀한 분류학적 재검토가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
