복잡해진 현대 사회에서 한의학적 치료 영역에서도 시대에 맞게 다양한 변화가 시도되어야 하나, 아직 한의학적 치료는 韓藥, 鍼灸, 附缸과 같은 전통적인 치료에 많은 부분이 할애되어 있다. 인체의 외적 부분에 질병이 표현되는 한방피부과 영역에서의 치료는 외용적 치료가 부가적으로 이루어져야 함에도 불구하고, 현재에도 전통적인 한의학적 치료에서 벗어나지 못하고 있는 실정이다. 환자의 만족도, 치료의 유효성을 높이기 위해서라도 임상현장에서 실제적으로 이용될 수 있는 외용적 치료제 및 치료기술의 개발이 적극적으로 필요하다.

한방피부과에서 손쉽게 활용할 수 있는 외용적 치료방법 중 하나는 도포법이다. 한약을 이용한 외용도포법을 임상에 활용할 경우 細末한 약제와 혼합할 용매가 필요하며, 용매는 자극성을 줄일 것인지, 혈액순환을 촉진 할 것인지, 영양을 보충할 것인지 등에 따라 아주 다양한 용매들을 이용할 수 있으며, 한의학에서도 환자 및 질병의 상태에 따라 혼합할 용매를 선택적으로 사용하였다.

최근 들어 다양한 종류의 추출용매가 등장하고 추출물의 효능을 연구하는 방법들이 개발되면서 추가적으로 고려되어야 할 사항으로 동일 약제라 하여도 추출용매에 따라 추출성분과 효능의 정도가 달라 질 수 있다는 것이다. 그러나 추출용매와 관련된 연구는 추출용매에 따라 추출률이 달라질 수 있다는 연구 보고이며1,2), 추출용매에 따른 추출물의 효능에 관련된 연구는 많이 이루어지지 않고 있다.

?絲子는 取汁하고 塗하는 방법으로 粉刺 등의 염증을 치료하는 외용 치료제로 소개되고 있어3), 이에 본 연구는 ?絲子를 에탄올과 물로 추출하여 세포독성, Nitric Oxide(NO) 생성 저해능, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 소거능, 항균 효능을 비교하여 추출용매에 따른 효과의 차이를 알아보고 ?絲子의 임상적인 활용가치를 높이고자 하였다.

1) 약물

본 실험에 사용된 ?絲子(CS)는 상지대학교부속한방병원 약제과에서 엄선하여 구입한 후 실험에 사용하였다.

2) 균주 및 세포주

Raw 264.7(Mouse Macrophage cell line) 세포주는 한림대학교 TIC, HaCaT(Human Keratinocyte cell line) 세포주는 강원대학교 생화학과, Propionibacterium acnes(KCTC 3314)를 한국 생명 공학 연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다.

3) 시약 및 기기

실험에 사용한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-gel)- 2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), N^G-methyl-L-arginine acetate salt(L-NMMA), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), Lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma(USA), Fetal Bovine Serum(FBS), Penicillin-Streptomycin, Dulbecco's modified Egale's medium(DMEM)/High glucose는 Hyclone(USA), Dimethyl sulfoxide(DMSO), 2-propanol Hueller-Hinton Broth은 Merck(USA)에서 구입하여 사용하였으며, ELISA reader(Perkin-Elmer, Foster City, CA), Spectrophotometer(UNICO.. USA), Micro centrifuge(Hettich, Germany) 등의 기기를 실험에 사용하였다.

1) 시료조제

CS 112 g을 분쇄한 후 56 g씩 나누어, 에탄올 추출물은 70% EtOH 500㎖와 혼합하여 교반기로 25℃에서 180분 동안 추출하고, 열수 추출물은 2차 증류수 1 ℓ와 혼합하여 약탕기로 100℃에서 150분 동안 전탕한 후 추출하였다. 각 추출물을 여과지(Whatman 4 → ADVANTEC 5C)로 여과하고 여과액을 회전감압농축기를 이용하여 완전 농축하고 에탄올 추출물은 50℃에서 EtOH 제거후 70℃에서 H2O를 제거하였고, 열수 추출물은 70℃에서 H2O를 제거하여 각각 3.03 g(수율 5.41%), 1.7 g(수율 3.03%)의 시료를 얻었다. CS 추출물을 microtube에 담은 후 100% DMSO를 이용하여 20 ㎎/㎖의 농도로 만들어 실험에 사용하였다.

2) 균주 및 세포 배양

Raw 264.7(Mouse Macrophage cell line) cell을 10% fetal bovine serum, penicillin(100 units/㎖), streptomycin(100 units/㎖)이 첨가된 DMEM 배지로 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 배지는 3~4일 간격으로 교체하고 배양용기에 90%이상 자라게 되면 계대 배양하여 실험에 사용하였다4). Propionibacterium acnes(KCTC 3314)의 생육배지로서 Reinforced-clostridial Broth를 사용하였으며 37℃, incubator에서 72시간 동안 배양하였다5).

3) 세포 독성 측정

Raw 264.7 세포를 배양접시의 바닥에 접종한 후, Penicillin(100 U/㎖), Streptomycin(100 ㎍/㎖), 10% FBS를 함유하는 DMEM배지를 넣고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. Raw 264.7세포를 96well plate에 5×10⁵/㎖의 농도로 희석하여 100 ㎕씩 접종한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 혈청이 포함되지 않은 배지 90 ㎕씩을 각 well에 넣고 CS 추출물의 농도가 20, 50, 100 ㎍/㎖가 되도록 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 희석한 시료를 10 ㎕씩 well에 처리하여 주었다. 24시간 배양 후 PBS를 이용하여 5 ㎎/㎖의 농도로 녹여져 있는 MTT 시약을 20 ㎕씩 넣어주고 4시간 배양하였다. MTT 시약과 시료가 포함된 배지를 모두 제거하고 각 well에 100 ㎕ acid isopropanol(0.04N HCl in iso-propanol)을 첨가하여 30분간 교반하여 주고, ELISA reader를 이용하여 570 ㎚에서 흡광값을 측정하였다6).

4) NO 생성 저해 효능 측정

96 well plate에 well당 5×10⁵/㎖의 Raw 264.7 세포가 들어있는 부유액 100 ㎕를 넣고 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 최종 농도가 20, 50, 100 ㎍/㎖가 되도록 CS 추출물을 처리한 후 염증 반응 유도인자인 LPS를 100 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 배양 후 배지를 이용하여 NO의 생성 정도를 측정하였다7). 세포배양액 50 ㎕와 Griess시약 50 ㎕를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 NO 생성 억제제인 NMMA를 50 uM이 되도록 시료와 같은 방법으로 처리하여 NO 생성 저해 효능을 비교하였다.

5) DPPH Radical 소거능 측정

DPPH의 환원성을 이용하여 CS의 DPPH Radical 소거 효과를 측정하였다. DPPH를 메탄올에 용해시켜 0.1 mM DPPH 용액 1 ㎖에 CS 추출물을 20, 50, 100 ㎍/㎖ 농도별로 제조하여 1 ㎖씩 넣어주고 잘 혼합하여 준 후, 실온에서 10분 동안 반응시킨 뒤 565 ㎚에서 흡광도를 측정하였다8). 양성 대조군으로 Quercetin 20 ㎍/㎖ 사용하여 같은 방법으로 처리하여 DPPH Radical 소거효과를 비교하였다.

6) 항균 효능 측정

항균 효능을 평가하기 위해 본 실험에서는 paper disk diffusion 방법을 사용하였다9). 10% DMSO에 stock되어 -70℃에 보관되어 있는 균주를 백금이를 이용하여 agar plate에 streaking하여 37℃ 에서 72시간 배양 하였다. 생성된 colony 하나를 백금이를 이용하여 broth배지에 접종하고 72 시간 동안 200 rpm, 37℃ shaking incubator에서 전배양 하였다. 전배양한 균 현탁액을 준비하고 이를 배양 액체배지로 희석하여 1.5×10⁸ cells/㎖의 농도로 준비하였고 균 희석액을 미리 준비해 둔 agar plate에 굳기 직전의 배지와 혼합하여 굳을때까지 정치하였다. 충분히 굳은 고체배지 위에 멸균된 paper disk를 올려놓은 후 20 ㎎/㎖의 농도로 희석되어진 시료를 disk에 loading 하였다. 50 ㎕/disk의 농도로 10분간 정치하여 시료가 모두 배지에 확산되어 흡수된 후, 균의 생장 최적 온도인 37℃에서 72시간 동안 배양하여 균의 생장 억제환의 직경을 측정하여 항균 활성을 측정하였다.

7) 통계분석

실험 결과는 SPSS 10.0 for Windows를 사용하여 평균±표준편차로 표기하고 유의수준은 p ？0.05로 하였다. 각 실험군 간의 통계적 유의성은 one-way ANOVA로 하였으며, 사후분석은 Duncan's multiple comparison test를 시행하였다.

CS 에탄올 및 열수 추출물의 Raw 264.7 세포에 대한 세포 독성 실험에서 에탄올 및 열수 추출물 모두 20 ㎍/㎖의 농도에서 80%, 50 ㎍/㎖의 농도에서 70%, 100 ㎍/㎖의 농도에서 50%의 세포 생존율을 보였다(Table 1).

CS 에탄올 및 열수 추출물의 LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에 대한 NO 생성 저해능 실험에서 열수 추출물 100 ㎍/㎖ 농도에서 약간의 NO 생성 저해능을 보였으나 유의성은 없었다(Table 2).

CS 에탄올 및 열수 추출물로 처리한 HaCaT 세포에 대한 DPPH Radical 소거능 실험에서 에탄올 추출물 20 ㎍/㎖에서 Quercetin 20 ㎍/㎖와 비슷한 효과를 50, 100 ㎍/㎖에서는 우월한 효과를 보여 유의성 있는 소거능을 보였다(Table 3).

CS의 여드름 유발균인 Propionibacterium acnes에 대한 항균 효능을 평가하기 위해 paper disk diffusion의 방법을 사용하여 Inhibition zone의 직경을 측정한 결과 CS는 항균 효능이 나타나지 않았다(Fig. 1).

외용약은 외치법에 의해 시술되는 것으로 국소적 혹은 전신적 치료를 목적으로 신체 외부에 직접 이용되는 약물로 본초를 적당하게 가공 제약하여 체외에 敷, ?, 擦, 吹, 点, 熏, 洗 등의 방법으로 각종 질병을 치료하거나 예방하고자 사용되며, 水, 酒, 蜜, 醋 등과 상온에서 혼합하거나 또는 가온하면서 혼합하여 국부에 적용하는 치료법이다10).

한약을 이용한 외용도포법을 임상에 활용할 경우 細末한 약제와 혼합할 용매는 질병의 성질에 따라 아주 다양하여, 가장 무난하게는 水를, 散瘀解毒에 醋를, 助行藥力에 酒를, 辛香散邪에 蔥·薑·?·蒜汁을, 淸凉解毒에 菊花·絲瓜 葉汁 및 銀花露를, 緩和刺戟에 鷄子淸을, 潤澤肌膚에 油를 사용한다. 또는 陽證에 菊花汁·銀花露를, 半陰半陽에 蔥·薑·?汁 및 蜂蜜을, 陰證에 醋·酒를 사용한다11). 이처럼 塗法을 활용함에 있어 혼합 용매는 다양하게 이용되어 왔다.

외용약을 이용한 여드름 치료와 관련된 연구 논문들을 살펴보면 서로 다른 외용약을 여드름 환부에 직접 도포한 임상적 논문12,13), 여드름에 활용되는 서로 다른 외용약의 염증과 관련된 기전을 연구한 실험적 논문14-16), 외용약을 중심으로 이전에 발표한 연구들을 review한 논문17)이 있었다. 외용약과 관련된 다른 연구들은 외용약에 대한 분류, 제형 등에 관한 연구로 혼합 용매에 따른 추출의 차이에 대한 연구는 이루어지지 않았다.

이에 동일 약제라 하여도 추출용매에 따라 추출성분과 효능의 정도가 달라 질 수 있음을 고려하여 粉刺에 외용 치료제로 塗法을 이용하여 활용되는 ?絲子를 일반적으로 쉽게 구입하여 사용하기에 가장 무난한 에탄올과 물로 각각 추출하여 세포독성, NO 생성 저해능, DPPH 소거능, 항균 효능을 비교하여 임상적 활용가치를 높이기 위하여 추출용매에 따른 차이를 알아보고자 하였다.

염증과 관련된 실험에 앞서 ?絲子 에탄올 및 열수 추출물의 Raw 264.7 세포에 대한 세포 독성 실험에서 에탄올 및 열수 추출물 모두 20 ㎍/㎖의 농도에서 80%, 50 ㎍/㎖의 농도에서 70%, 100 ㎍/㎖의 농도에서 50%의 세포 생존율을 보였다. 100 ㎍/㎖의 농도에서 50%의 세포 생존율을 보여 활용 농도는 100 ㎍/㎖ 이하로 하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.

염증반응은 세포손상을 일으키는 자극이나 손상인자를 제거하거나 희석을 위한 생체 방어로서, 혈관을 가진 결합조직에서 볼 수 있는 복합적 반응으로 많은 화학적 물질에 의하여 매개된다18). LPS, cytokine 및 bacterial toxin 같은 세포손상을 일으키는 자극이나 손상인자들에 의해 iNOS의 발현이 증가하게 되며, iNOS는 L-arginine을 L-citrulline으로 전환시키면서 반응성이 강한 자유라디칼인 NO를 생성하고 과량의 NO는 염증반응을 매개한다19).

?絲子 에탄올 및 열수 추출물의 LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에 대한 NO 생성 저해능 실험에서 열수 추출물 100 ㎍/㎖ 농도에서 약간의 NO 생성 저해능을 보였으나 거의 미미하였으며 유의성은 없었다. 결과적으로 ?絲子 추출물은 항염 효과는 없는 것으로 판단된다.

활성산소란 산소가 가지는 화학적 특성으로 인하여 생성되는 free radical 및 이로부터 유래된 산소화합물로 높은 반응성을 바탕으로 생체 내에서 DNA나 세포막 등에 작용하여 산화적 손상을 일으킨다고 보고 되고 있다20). 그러나 활성산소는 면역활동 등 생명에 필수적인 역할을 하며, 각종 염증반응에 있어서도 관여되므로 항염과 함께 항산화에 대한 효능을 살펴보는 것은 염증성 질환에 응용할 수 있는 韓藥을 연구하는데 필수적이라 할 수 있다21). DPPH는 안정한 유리기로 cysteine, glutathione과 같은 아미노산과 ascorbic acid, aromatic amine 등에 환원되어 탈색되므로 항산화물질의 항산화능을 측정할 수 있다.

?絲子 에탄올 및 열수 추출물로 처리한 HaCaT 세포에 대한 DPPH 라디컬 소거능 실험에서 에탄올 추출물 20 ㎍/㎖에서 Quercetin 20 ㎍/㎖와 비슷한 효과를 50, 100 ㎍/㎖에서는 우월한 효과를 보여 유의성 있는 소거능을 보였다. 결과적으로 에탄올 추출이 열수 추출보다 나은 항산화효과를 보여 에탄올 추출물을 활용하는 것이 효과적일 것이라 사려된다.

Propionibacterium acnes는 혐기성 그람양성균으로 여드름 유발균으로 알려져 있으며 피지가 없이는 거의 발육할 수 없는 호지성균이다. 따라서 P. acnes의 증식은 피지가 많은 부위에 한정되어 있으며 지방분해효소와 화학주성인자를 분비하여 피지를 triglyceride와 유리 지방산으로 가수분해하고 유리 지방산은 모낭벽을 파괴하여 모낭 내용물이 진피내로 유출되면서 염증반응이 일어나게 된다. 따라서 여드름을 억제시키고 치료하기 위해서는 피지 생성과 염증반응을 억제시키는 노력과 함께 P. acnes의 증식을 억제시키는 것이 필요하다22).

?絲子 에탄올 및 열수 추출물로 Propionibacterium acnes에 대한 항균 효능을 평가하기 위해 paper disk diffusion의 방법을 사용하여 항균 효능을 측정하였으나 항균 효능은 전혀 나타나지 않았다.

전체적으로 ?絲子를 외용 치료제로 사용하여 粉刺에 효과적으로 활용하기 위해서는 에탄올 추출을 하는 것이 항산화능을 높일 수 있는 방법이라 사려된다.

?絲子의 에탄올 및 열수 추출에 따른 항염과 항산화능을 살펴본 결과는 다음과 같다.

1. ?絲子의 에탄올 및 열수 추출물 100 ㎍/㎖에서 50%의 세포생존율을 보였다.

2. ?絲子의 에탄올 및 열수 추출물 모두 NO 생성 저해능은 없었다.

3. ?絲子의 에탄올 추출물에서 유의성 있는 DPPH 라디컬 소거능을 보였다.

4. ?絲子의 에탄올 및 열수 추출물 모두 Propionibactrium acnes에 대해 항균성이 나타나지 않았다.

이상의 결과를 종합해 보면 ?絲子의 粉刺에 대한 외용적 활용은 에탄올 추출물이 효과적일 것으로 사료된다.