간암은 세계적으로 가장 빈도가 높은 악성종양으로 B형, C형 간염바이러스 및 다양한 간의 만성질환이 원인이 된다. 증상은 피로, 식욕부진, 체중 감소로부터 시작하며 진행하면서 황달, 복수 및 전신 쇠약 증세가 나타난다1).

한의학의 역대 문헌 중에서 肝癌과 유사한 병증은 黃疸, 積聚, 脇痛, 鼓脹, 蟲門등에서 볼 수 있으며2), 癌의 형성은 正氣不足, 六鬱, 七情所傷, 起居不節, 飮食不節, 努力過度등의 복합적인 상호연계작용에 의해 이루어지는 것으로 알려져 있다3).

간암의 治療法으로 西洋醫學에서는 최근 간동맥 색전술, 간동맥 내 주입 화학요법 및 파괴적 알코올 주입법 등의 비수술적 요법의 진보에 힘입어 간암의 예후가 개선되었다는 보고들이 있으나 아직까지는 간 절제 수술에 비교 될만한 치료법은 없는 것으로 알려졌다4).

한의학에서는 현대에 이르러 서양의학적인 개념이 도입됨으로써 간암에 대한 새로운 인식과 실험적 연구가 진행되어 Lim et al5) 등은 진인화철탕이, Baek et al6) 등은 팔진항암단이 간암세포에 항암효과가 있음을 보고하였으며 Seo et al7) 등은 간암환자 67례에 대한 임상 보고를 하여 간암에 대한 한방치료가 암의 전이 및 재발방지 목적과 항암 및 면역증진 목적으로 활용가능하며 우수한 치료효과 가 있다고 보고하였다.

扶正抗癌湯은 원광대학교 한방병원에서 각종 암 치료에 사용되는 경험방으로서 健脾, 益氣, 祛痰, 補腎, 抗癌하는 치료효과를 갖는 약물로 구성되어 있으며, 이에 대한 최근의 연구로는 Lim et al8), Moon et al9), Jeon et al10) 등이 항암 효과가 있음을 보고하였으나, 扶正抗癌湯의 肝癌에 대한 직접적인 항암 효과에 대한 보고는 아직 없었다.

이에 저자는 扶正抗癌湯이 肝癌형성과 간경화에 미치는 영향을 규명하기 위해 흰쥐에게 Diethylnitrosamine(DENA)과 CCl4를 투여하여 肝癌, 肝硬化를 유발시켰다. 다음으로 扶正抗癌湯추출액을 경구 투여하여 체중변화를 관찰하고, 간 손상 보호효과를 알아보기 위해 AST활성, ALT활성, ALP활성, SOD활성, Catalase 활성, 광학현미경 관찰, 전자현미경 관찰 등을 살펴보고, 肝癌에 대한 항암효과를 알아보기 위해 LDH 활성, AFP 활성, p53 면역조직화학적 변화 등을 관찰한 결과 유의성 있는 결과 를 얻었기에 보고하는 바이다.

1) 실험동물

체중 200±10g 내외의 7주령 흰쥐(Sprague Dawley)를 샘타코(오산, 한국)로부터 구입하였다. 실험동물은 동신대학교 한의과대학 동물 사육실에서 일정한 조건(온도 : 21±2℃, 습도 : 50-60 %, 12시간 명/암 주기)하에서 일반 고형사료(샘타코, 흰쥐 용)와 물을 충분히 공급하면서 1주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

2) 扶正抗癌湯의 구성

실험에 사용한 약재는 원광대학교 부속광주한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였다. 扶正抗癌湯(Bujeonghangam-tang, 이하 "BH")의 처방구성과 용량은 임상에서 다용하였던 경험방에 준하였으며 1貼의 分量은 다음과 같다(Table 1.)

1) 약물 추출

扶正抗癌湯4첩을 정제수 3000 ml와 같이 혼합하여 약탕기(고려, 한국)로 100 ℃에서 3시간 동안 가열하여 농축하였다. 저온순환수조(COOL ACE CA-1500)에서 1차 동결한 다음 동결건조기(Samwon, SFDSMO06, 한국)로 동결 건조하여 39.6 g의 분말을 얻었다. 얻어진 부정항암탕 추출물은 -20 ℃의 냉장고에 보관하여 실험에 사용하였으며, 실험에 따라 필요한 농도로 증류수에 희석하여 사용하였다.

2) 간암과 간경화 유발

정상군을 제외한 모든 실험동물은 Diethylnitrosamine(DENA, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) 200mg/kg을 0.9 ％ 식염수 1 mL에 용해하여 1주 간격으로 2회 복강투여 하였다. DENA를 2회 투여한 다음 1주 후부터 Carbon tetrachloride(CCl₄, SigmaChemical Co., St Louis, MO)와 corn oil을 1:1로 희석한 약물 1mL를 1주 간격으로 3회 복강 투여하여 간암을 유발하였다.

3) 실험군 설정 및 약물 투여

정상군은 통상적인 사료와 물을 공급하였으며, 대조군 흰쥐는 간암이 유발된 후부터 식염수 0.5 mL를 실험기간 동안 매일 구강 투여하였다. 실험군은 DENA를 투여한 2주 후부터 실험기간(8주, 12주) 동안 扶正抗癌湯추출액 건조분말을 생리식염수에 0.5 mL에 용해하여 체중 60 kg인 사람의 1일 투약량인 320 mg/kg(이하BHA군)과 2배에 해당하는 640 mg/kg(이하 BHB군)을 8주(이하 BHA-8군, BHB-8군)와 12주(이하 BHA-12군, BHB-12군) 동안 구강 투여하였다.

1) 체중 측정

대조군과 실험군의 체중은 1주 간격으로 실험기간 동안측정하였으며, 체중 측정 12시간 전부터 금식시켰다.

2) 혈청 Transaminase 활성 측정

혈청 중 aspartate aminotransferase(AST)와 alanine aminotransferase(ALT)의 활성 측정은 Reitman- Frankel의 방법11)에 따라 kit 시약(아산제약)을 사용하여 측정하였다. AST와 ALT 기질액 1.0 mL을 시험관에 넣고 37 ℃에서 5분간 방치한 다음 혈청 0.2 mL를 넣어 잘 혼합한 다음 37 ℃에서 AST는 60분, ALT는 30분간 반응시킨 다음 정색시액 1.0 mL을 첨가하여 잘 혼합하여 실온에서 20분간 방치하여 반응을 종료시키고, 0.4NNaOH 용액 10 mL을 가하여 잘 혼합한 다음 실온에서 약 10분간 방치하였다가 505 nm에서 흡광도(photometer 5010, Germany)의 변화를 측정하였다.

3) Alkaline phosphatase(ALP) 함량 측정

ALP 활성도 측정은 Reitman-Frankel 방법에 의한 kit 시약(아산제약, 한국)을 사용하여 405nm에서 측정하였다.

4) Lactate dehydrogenase(LDH) 함량 측정

LDH 활성도 측정은 Reitman-Frankel 방법에 의한 kit 시약(아산제약, 한국)을 사용하여 340nm에서 측정하였다.

5) Serum alpha fetoprotein(AFP) 측정

심장 채혈하여 획득한 혈액(10 ㎕)를 증류수 40 ㎕에 희석하였다. 혈액 샘플은 AFP를 측정하기 전까지 -80 ℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 그 다음 AFP ELISA kit(Sierra Resources International, Inc., Valrico, FL)를 이용하여 완충액에 희석된 혈액 샘플 10 ㎕에서 혈청 내 AFP 농도를 측정하였으며, 제조사의 실험방법에 따 라 수행하였다12-13).

6) SOD 추출 및 활성도 측정

대조군과 실험군 흰쥐로부터 EDTA(K3) 처리된 vacutainer에 전혈을 수집한 후, 전혈 1.0 mL에 0.85 % NaCl을 혼합한 다음 3000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상층액 제거 후 pellet을 3회 반복 실시한 다음, 증류수를 첨가하여 total volume을 4 mL로 맞춘 후 ethanol 1 mL와 chloroform 0.6 mL을 넣고 vortex한 다음 4 ℃ 에서 3000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 증류수로 희석하여 검체로 사용하였다. SOD 활성도는 SOD assay kit(Dojindo, Japan)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정 후 SOD 활성도를 계산하였다.

7) Catalase 추출 및 활성도 분석

Catalase 활성도 측정은 Beers and Sizer(1952)의 방법14)에 준하여 50 mM 인산칼슘 완충액(pH 7.2)에 기질인 10 mM H2O2 에 효소액을 가하여 최종 반응액이 3.0 ㎖가 되게 한 다음 25 ℃에서 30초간 반응시키면서 240 nm 파장에서 소실되는 H2O2의 양을 측정하였다. 효소 활성도의 단위는 15초간에 1 mg의 단백이 반응하여 환원시킨 H2O2를 μmole로 나타내었다.

8) 광학현미경 관찰

생쥐의 간 조직을 적출하고 Bouin 용액을 사용하여 24시간 동안 고정시킨 다음, 30, 50, 70, 80, 90, 95, 100 I, 100 II와 같이 알코올 농도를 상승시켜 탈수한 다음 xylene으로 투명화 과정을 거친 후 paraffin으로 포매하였고, 포매된 조직을 microtome을 사용하여 6 μm 두께로 절편하였다. 절편한 조직을 slide glass 위에 부착시키고 xylene으로 paraffin을 제거한 다음 100 %, 90 %, 80 % ethanol 과 같이 농도가 낮아지는 순으로 5분씩 담구어 함수과정을 거치게 하였다. Hematoxylin과 Eosin으로 이중염색을 한 다음 탈수하였다. Canada balsam으로 봉합한 후 카메라 부착 광학현미경(Olympus BX51, Japan)으로 관찰한 후 사진을 촬영하였다.

9) p53 면역조직화학

흰쥐의 간 조직을 적출하여 Bouin 용액을 사용하여 24시간 동안 고정시킨 다음, paraffin으로 포매한 후 microtome을 사용하여 조직을 6 μm 두께로 절편하였다. 절편한 조직을 slide glass 위에 부착시킨 다음 이를 xylene에서 paraffin을 제거한 다음 100 %, 90 %, 80 % ethanol과 같이 농도가 낮아지는 순으로 5분씩 담구어 함수과정을 거치게 하였다. 12시간 후 pH 7.2, 0.1 M의 phosphate buffer saline(PBS, 0.9 % NaCl) 용액에 24시간 동안 배양시킨 다음 15분간 PBS로 세척한 뒤 10 % horse serum을 함유한 blocking solution을 사용하여 20분 동안 배양시키고 다시 PBS용액으로 15분간 세척하였다. 세척한 각각의 조직위에 polyclonal anti mouse COX-2 항체(Cayman Chemical Co.)를 각각 처리하고 습도가 높은 상온의 배양접시에서 2시간 동안 배양시킨 뒤 15분간 PBS용액으로 세척하였다. 그리고 2차 항체 biotinylated anti-mouse IgG를 처리하여 60분간 배양시킨 후 15분간 PBS용액으로 세척하였다. 이를 다시 3차 항체 avidin-biotinylated enzyme complex(ABC) regent (Vector Lab, CA, USA)를 조직에 처리 30분간 반응시키고 다시 PBS용액에서 15분간 세척하였다. DAB(3, 3'-diaminobenzide) 발색시약을 조직에 떨어뜨려 2분간 발색시키고 난 후 흐르는 물에 과량의 염색시약을 제거하였다. 물기를 제거한 후 여과시킨 hematoxylin에 20초간 대조염색을 한 다음 통상적인 방법에 따라 표본을 제작하여 카메라 부착 광학현미경(Olympus BX51, Japan)으 로 관찰한 후 사진을 촬영하였다.

10) 전자현미경 관찰

전자현미경 관찰을 위하여 광학현미경 시료와 동일한 부위의 조직을 절취하여 전고정액 속에서 1 mm³ 크기로 세 절한 후 2.5 % glutaraldehyde(phosphate buffer, pH 7.4)로 2시간 동안 전고정 하였다. 전고정이 끝난 조직은 동일 완충액을 사용 10분 간격으로 3회 세척한 다음 1 % osmium tetroxide(OsO₄)로 2시간 후 고정 한 다음 동일 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 후 시료들은 상승 농도 의 에탄올로 탈수하여 propylene oxide로 치환한 다음 Epon- Araldite 혼합액으로 포매하였고 60 ℃ 오븐에서 30시간 중합시켰다. 포매된 조직들을 LKB-Ⅴ형 ultramicrotome을 사용 1 ㎛두께로 절편을 제작하여 1 % toluidine blue로 hot plate(60 ℃) 상에서 염색하였다. 염색된 시료를 광학현미경으로 관찰하여 조직을 확인한 다음 동일한 부위에서 60 nm두께로 초박 절편을 제작하여 silver grid에 부착하였고, uranyle acetate 와 lead citrate로 이중 염색한 다음 JEM 100 CX-II 투과형 전자현 미경(80 KV)으로 관찰하였다.

실험 결과에 대한 통계분석은 SAS(statistical analsissystem) program의 Ducan's multiple range test에의하여 각 실험군 별로 평균치와 표준오차를 계산하였고,p-value가 최소한 0.05이하의 수준에서 유의성을 검정하였다.

간 손상을 유발하고 간암 유발 약물을 투여한 다음 12주 동안 체중을 측정하였다. 그 결과 대조군의 체중은 정상군에 비하여 4주부터 통계적으로 유의성(^*p＜0.05)있게 감소하여 12주까지 계속되었다. BHA군은 2주, 6주, 8주군에서 정상군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, BHB군은 8주군에서만 정상군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 12주 후 정상군의 체중(480±18.92 g)에 비하 여 대조군(423±10.07 g)의 체중은 약 13 % 감소하였으며, 실험군인 BHA군(442±3.50 g)은 약 8 %와 BHB군(437± 8.15 g)은 약 9 % 감소하였으나 통계적인 유의성은 없었다. 전반적으로 扶正抗癌湯추출액이 투여된 실험군의 체중이 대조군에 비하여 모든 실험기간 동안 다소 높았다(Fig. 1).

1) Aspartate aminotransferase

① 8주군

8주군에서 AST의 활성은 정상군에(95±5.86 U/L) 비하여 대조군(179±7.03 U/L)은 통계적으로 유의성(^*p<0.05)있게 증가하였으며, BHA-8군(103±5.68 U/L)과 BHB-8군(97±6.03 U/L)은 정상군과 비슷하였으며, 통계적으로 대조군에 비하여 유의성(^#p<0.05)있게 16 감소하였다(Fig. 2A).

② 12주군

12주군에서도 AST의 활성은 정상군에(90±6.09 U/L) 비하여 대조군(120±6.30 U/L)과 扶正抗癌湯추출액을 12주 동안 투여한 BHB-12군(114±5.38 U/L)은 통계적으로 유의성(^*p<0.05)있게 증가하였으며, BHA-12군(106±7.16 U/L)은 다소 증가하였으나 통계적인 유의성은 없었다(Fig. 2B).

2) Alanine aminotransferase

① 8주군

ALT의 활성은 정상군(57±4.77 U/L)에 비하여 대조군(82±3.62 U/L)에서 통계적으로 유의성(^*p<0.05)있게 증가하였고, 실험군인 BHA-8군(72±5.11 U/L)은 정상군에 비하여 다소 높은 활성을, 특히 BHB-8군(57±5.13 U/L)은 정상군과 비슷한 활성을 보였는데 이와 같은 활성의 감소는 대조군에 비하여 통계적으로 유의성(^#p<0.05)있 는 감소였다(Fig. 2C).

② 12주군

12주군에서 ALT의 활성은 정상군(76±5.38 U/L)과 간 손상이 유발된 대조군(78±3.91 U/L)은 비슷한 활성을 보였으며, BHA-12군(68±9.93 U/L)은 효소활성이 감소하였으나 통계적인 유의성은 없었다. 扶正抗癌湯추출액 과량을(640 mg/kg) 투여한 BHB-12군(81±5.10 U/L)에 서는 오히려 효소 활성이 조금 높았으나 통계적인 유의성 은 없었다(Fig. 2D).

1) 8주군

ALP의 활성은 정상군(227±9.66 U/L)에 비하여 대조군(348±28.79 U/L)은 약 54 % 증가하여 통계적인 유의성(^*p<0.05)이 있었으며, BHA-8군(237±20.39 U/L)은 대조군에 비하여 유의성(^#p<0.05)있게 활성이 감소하였다. 한편 BHB-8군(260±31.85 U/L)은 대조군에 비하여 약 25 % 감소하였으나, 정상군에 비하여 다소 증가하였으며 유의성은 없었다(Fig. 3A).

2) 12주군

扶正抗癌湯추출액을 12주 동안 투여한 다음 혈액을 채취하여 ALP를 측정한 결과 정상군(165±8.46 U/L)에 비하여 대조군(263±10.38 U/L)과 BHB-12군(245±21.55 U/L) 모두 통계적으로 유의성(^*p<0.05)있게 증가 하였다. 실험군인 BHA-12군(253±38.20 U/L)은 활성이 높아지기는 하였으나 유의성은 없었다(Fig. 3B).

1) 8주군

LDH의 활성은 정상군(2724±206.79 U/L)에 비하여 대조군(5293±282 U/L)에서는 약 94% 증가하여 통계적으로 유의성이 있었으며 扶正抗癌湯추출액을 8주 동안 투여한 실험군인 BHA-8군(2470±424.40 U/L)과 BHB-8군(3440±359 U/L)은 대조군에 비하여 통계적으로 유의성(^#p<0.05)있게 감소하였다(Fig. 4A).

2) 12주군

12주군에서 LDH의 활성은 정상군(2192±284 U/L) 에 비하여 대조군(3931±297 U/L)에서는 통계적으로 유의성(^*p<0.05)있게 활성이 증가하였으며, 실험군인 BHA-12군(3139±334 U/L)은 대조군에 비하여 약 19% 감소하였으며, BHB-12군(2494±323.83 U/L)은 약 37% 감소하여 통계적인 유의성(^#p<0.05)이 있었다 (Fig. 4B).

1) 8주군

扶正抗癌湯추출액을 투여한 다음 8주 후 혈청 AFP의 농도를 측정한 결과 정상군(2.78±0.29 ng/mL)에 비하여 간손상과 간암 유발 약물인 DENA을 투여한 다음 생리식 염수를 투여한 대조군(5.51±0.86 ng/mL)은 통계적으로 유의성(^*p<0.05)있게 증가하였으며, 扶正抗癌湯추출액을 투여한 실험군인 BHA-8군(3.07±0.41 ng/mL)과 BHB-8군(3.18±0.62 ng/mL)은 정상군에 비하여 다소 높지만 대조군에 비하여 감소하였다. 특히 BHA-8군은 통계적으로 유의성(^#p<0.05)있게 감소하였다(Fig. 5A).

2) 12주군

扶正抗癌湯추출액을 투여한 다음 12주 후 혈청 AFP의 농도를 측정한 결과 정상군(2.47±0.15 ng/mL)에 비하여 대조군(17.12±8.75 ng/mL)은 약 7배정도 증가하였을 뿐만 아니라 실험군인 BHA-12군(5.30±0.77 ng/mL)과 BHB-12군(3.58±0.24 ng/mL)은 대조군에 비하여 약 70 %와 80 % 감소하였으나, 정상군에 비하여 통계적으로 유의성(^*p<0.05)있게 증가하였다(Fig. 5B).

1) 8주군

8주군에서 혈액을 채혈하여 SOD의 활성을 측정한 결과 정상군(102±2.04 %)에 비하여 대조군(133±3.70 %)과 실험군 모두 증가하여 통계적으로 유의성(^*p<0.05)이 있었으며, 실험군인 BHA-8군(121±3.52 %)과 BHB-8 군(125± 4.55 %)의 활성은 대조군에 비하여 다소 감소 하였다(Fig. 6A).

2) 12주군

扶正抗癌湯추출액을 12주군 동안 투여한 흰쥐의 혈액을 채혈하여 SOD의 활성을 측정한 결과 정상군(116± 4.60 %)에 비하여 대조군(138±4.49 %)은 통계적으로 유의성(^*p<0.05)있게 증가하였으며, 실험군인 BHA-12군 (122±1.83 %)과 BHB-12군(119±3.74 %)의 활성은 대조군에 비하여 통계적으로 유의성(^#p<0.05)있게 감소하 였다(Fig. 6B).

1) 8주군

8주군에서 흰쥐의 혈액내 catalase의 활성을 측정한 결과 정상군(221±5.44 U/mL)에 비하여 대조군(198±15. 50 U/mL)에서 가장 낮게 나타났으며, 실험군인 BHA-8 군(284±16.19 U/mL)과 BHB-8군(269±11.00 U/mL)은 정상군이나 대조군에 비하여 통계적인 유의성 (^*#p<0.05)있게 증가하였다(Fig. 7A).

2) 12주군

扶正抗癌湯추출액을 12주 동안 추출한 흰쥐의 혈청을 취하여 catalase의 활성을 측정한 결과 정상군(276±19.18 U/mL)에 비하여 대조군(224±10.35 U/mL)의 활성은 감소하였으며, 실험군인 BHA-12군(268±6.00 U/mL)은 정상군의 활성과 비슷하였으며 대조군에 비하여 통계적으로 유의성(^#p<0.05)있게 증가하였다. BHB-12군(262±11.96 U/mL)은 정상군과 비슷하였다(Fig. 7B).

1) 8주군

정상군의 간조직은 중심정맥과 혈액으로 차있는 동굴모세혈관이 관찰되었는데 간세포의 세포질은 eosin에 염색이 고르게 되어있으며, 핵은 둥글게 나타났다(Fig. 8). 대조군은 중심정맥이 위축되어 있었으며 동굴모세혈관은 관찰되지 않았다. 중심정맥 주위의 간 조직에서는 핵이 소실 되어 있고 세포질의 염색성이 미약한 파괴된 간세포의 집단이 관찰되었다. 간 조직에서는 세포질이 Eosin에 강하에 염색되어 호산성을 보이고 핵은 Hematoxylin에 강하게 염색되어 호염기성을 보이는 간세포들이 드물게 관찰 되었다(Fig. 8). BHA-8군은 비교적 타원형의 중심정맥을 중심으로 간 조직들이 구획화되어 결절 모양을 이루었다. 간 조직에서는 사염화탄소에 의하여 손상된 것으로 보 이는 세포들이 관찰되었으며, 중심정맥에서 비교적 멀리 있는 세포들은 호산성을 띄고 있었다(Fig. 8). BHB-8군 은 타원형의 중심정맥을 중심으로 주위는 염색성이 비교적 약하고 멀어질수록 강하게 나타났다. 호염기성을 보이는 커다란 핵을 갖는 간세포들이 다수 관찰되었다(Fig. 8).

2) 12주군

12주 대조군에서는 8주에 비하여 보다 많은 세포들이 호산성을 보여 주었을 뿐만 아니라 핵은 강한 염기성을 보여 주었다. 간 조직 전반에 걸쳐 8주군에 비하여 핵의 밀도가 매우 증가하였을 뿐만 아니라 비교적 커다란 핵을 갖는 세포들이 다수 관찰되었다(Fig. 9). BHA-12주군의 간 조직은 비교적 둥근 중심정맥 주변에서 사염화탄소에 의해 손상된 조직들이 일부 관찰되었다. 대조군에 비하여 미약하지만 호산성을 보이는 세포들이 다수 관찰되었으 며, 비교적 크고 호염성을 보이는 핵들이 다수 관찰되었다. 전반적으로 핵의 밀도는 대조군에 비하여 낮았다(Fig. 9). BHB-12주군은 비교적 불규칙형태의 중심정맥이었으나 동굴모세혈관은 뚜렷이 관찰되었다. 간 조직은 대조군에 비하여 미약하지만 다수의 호산성세포들이 관찰되었으며, 핵의 밀도 또한 대조군에 비하여 낮았다(Fig. 9).

1) 8주군

정상군에서는 p53에 대한 면역반응성이 거의 관찰되지 않았으며, 동굴모세혈관의 혈액과 Kupffer 세포에서 미약한 면역반응성이 나타났다(Fig. 10). 대조군 8주의 간 세포에서는 중심정맥 주위의 간세포들에서 p53에 강한 면역반응성을 보여 주었을 뿐만 아니라 관찰되는 간 조직에서 고르게 분포되어 있었다(Fig. 10). 扶正抗癌湯추출액을 8주간 투여한 BHA-8군에서는 대조군에 비하여 p53에 면역반응성을 보이는 세포들의 수가 적었을 뿐만 아니라 면역반응성 또한 낮았다. 전반적으로 중심정맥 주변의 간세포와 동굴모세혈관 속의 물질에서 강한 면역반응성을 보여 주었다(Fig. 10). BHB-8군은 대조군과 BHA-8군에 비해서 전반적으로 p53에 대하여 면역반응성은 미약하였다. 중심정맥 주위의 소수 간세포와 동굴모세혈관 물질에서 미약한 반응성을 보였다(Fig. 10).

2) 12주군

대조군 12주의 간세포에서는 p53 면역반응성은 세포질 보다는 핵에서 강한 반응성을 보여주었다. 면역반응성을 보이는 세포의 수는 8주 대조군에 비하여 증가하였다 (Fig. 11). 扶正抗癌湯추출액을 12주 동안 투여한 BHA-12군에서는 대조군에 비하여 면역반응성을 보이는 세포의 수는 소수이었으나, 동굴모세혈관의 물질에서는 약한 면역반응성을 보였다(Fig. 11). BHB-12군에서는 대조군에 비하여 미약한 p53 면역반응성을 보여주었을 뿐 만 아니라 대부분 세포들이 정상적인 간 조직 소견을 보여 주었지만 동굴모세혈관 물질에서는 면역반응성이 다소 높게 관찰되었다(Fig. 11).

대조군 8주의 간세포는 핵의 핵막이 둥글고 핵질이 고르게 관찰되었다. 핵 주변에서 관찰되는 다수의 사립체들은 둥글거나 타원형이었으며 크리스테의 형태가 비교적 뚜렷하였다. 핵 주변에서 관찰되는 과립세포질세망은 층판구조를 이루고 있었지만 발달은 미약하였다. 세포질에서는 세포소기관이 관찰되지 않은 영역들이 있었다(Fig. 12). 대조군 12주의 간세포에서 관찰되는 핵의 핵막은 비교적 둥글게 관찰되었지만 내막과 외막이 뚜렷이 분리 되어 있었다. 과립세포질세망은 층판구조를 이루고 있거나 산재되어 있었는데, 내강이 매우 팽창되어 있었고 주위에서는 수많은 분비소포들이 집적되어 있었다. 사립체들은 대부분 산재되어 있는 과립세포질세망의 사이에서 관찰되었으며 크기는 다양하고, 크리스테는 비교적 뚜렷하였다(Fig. 12).

扶正抗癌湯추출액을 8주 동안 투여한 BHA-8군의 핵은 핵막이 둥글고 핵질이 고르게 발달해 있었으나 핵막은 내막과 외막이 분리되어 내강이 뚜렷하게 관찰되었다. 과립세포질세망은 내강이 매우 팽창되어 있었으며, 그 사이 에서는 세장형의 사립체들이 다수 관찰되었으며, 다양한 크기의 분비소포들이 관찰되었다(Fig. 13). BHB-8군의 핵은 핵막이 둥글고 핵질이 고르게 발달해 있었으며, 커다란 핵소체를 갖고 있었다. 핵막은 BHA-8군에서와 같이 내막과 외막이 다소 분리되어 있었다. 과립세포질세망은 매우 발달해 층판구조를 이루거나 세포질에 흩어져 있었는데, 내강은 다소 팽대되어 있었고 주변에서는 많은 분비 소포들이 관찰되었다. 사립체들은 대부분 세장형으로 관찰되었으며, 대부분 크리스테의 형태가 뚜렷하였다(Fig. 13).

扶正抗癌湯추출액을 12주 동안 투여한 BHA-12군의 간세포는 핵의 핵막이 비교적 둥글고 내막과 외막이 다소 분리되어 있었다. 핵의 중앙에 커다란 핵소체가 있었다. 과립세포질세망은 비교적 층판구조를 이루고 있거나 산재해 있었는데 발달은 미약하였으며 내강은 다소 팽대되어 있었다. 세포질에서는 수많은 분비소포들이 집적되어 있었다(Fig. 14). BHB-12군의 간세포는 핵의 핵막이 둥글고 핵질이 고르게 발달해 있었으며, 외막과 내막은 약간 분리되어 있었다. 핵 주변에서는 세장형의 사립체들이 다수 관찰되었다. 과립세포질세망은 주로 층판구조를 이루고 있었는데 매우 발달해 있었으며, 내강의 팽대는 아주 미약하였다. 핵 주위 세포질을 포함한 여러 곳에서 수많은 분비소포들이 관찰되었다(Fig. 14).

우리나라 男性癌疾患中 2位, 女性癌疾患中 5位를 차지하고 있는15) 肝癌은 原發性肝癌과 轉移性肝癌으로 區分 할 수 있는데16) 原發性肝癌의 정확한 原因은 不明이나 飮食物 섭취의 부적절한 習慣, 肝디스토마, 肝炎 및 B형 virus 肝炎, 慢性肝疾患, 眞菌毒素, 호르몬 및 家族的素質 등을 들 수 있다16-17).

肝癌의 症狀은 食慾不振, 全身衰弱, 體重減少, 上腹痛, 惡心, 嘔吐, 下痢, 發熱, 發汗 등이 나타나고 癌이 進行하면 肝은 커지고 腫瘤를 생성하며 黃疸, 腹水, 出血 등이 나타난다16-17). 이에 대한 治療法으로 西洋醫學에서는 外科的治療, 放射線治療, 化學治療, 肝動脈塞栓術 등을 活用하나17) 豫後가 不良하여 대개 診斷後 6個月以內에 死亡하게 되는 경우가 많다18).

韓醫學에서 肝癌은 肝積, 肥氣, 堅, 肝脹, 肝著, 癖黃, 疲？, 積聚, 黃疸, 鼓脹, 脇痛 등의 範疇에서 取扱 할 수 있는데19) 「靈樞 · 邪氣臟腑病形』20)에 "肝脈......微急爲肥氣在脇下, 若覆杯" 「難經』21)에 "脾之積名曰氣, 在胃脘, 覆大如盤, 久不愈, 令人四肢不收, 發黃疸, 飮食不爲肌 膚", 「諸病源候論』22)에 "診得肝積, 脈弦而細, 兩脇下痛", 「聖濟總錄』23)에 "積氣在腹中, 久不差, 牢固推之不移者疲也......按之其狀如杯盤牢結, 久不已, 令人身瘦而腹大, 至死不消"라고 하여 肝癌의 病變部位와 主要症狀을 表現하였다.

肝癌의 病因은 情緖變化, 內臟虛損, 蛋白質이나 비타민B 등의 營養素缺乏, 無節制한 食事習慣, 寒冷과 溫熱에 대한 不適應 및 病毒感染 등으로 인하여 誘發된다고 하였다19).

肝癌에 활용되는 治療法으로는 疏肝理氣, 活血化瘀, 淸熱利濕, 解毒破結, 養陰淸熱, 解毒祛瘀, 淸熱解毒法, 軟堅化瘀, 疏肝散結, 活血止痛, 利濕行氣, 開窺逐水法 등이 있으며19,24), 淸肝湯, 十六味流氣飮, 托裏和中湯, 肝癌飮, 淸熱活血散結湯, 增減旋覆花代石湯, 肥氣丸, 仙方活命飮, 疏肝流氣飮, 白朮龜甲湯, 加味茵蔯湯, 加味對金飮子 등을 活用 할 수 있다고25) 하였으나 이에 대한 체계적인 硏究는 거의 없는 실정이다.

扶正抗癌湯은 黃？, 人蔘, 白朮, 陳皮, 半夏, 女貞子, 何首烏, 薏苡仁, 破古紙, 龍葵, 楡根白皮, 甘草, 鬼箭羽로 구성되어 있으며 健脾, 益氣, 祛痰, 補腎, 抗癌 및 면역력 증강의 效能이 있다26-28).

扶正抗癌湯에 대한 최근의 연구로는 Lim et al8), Moon et al9), Jeon et al10) 등이 항암 효과가 있음을 보고 하였으나, 扶正抗癌湯의 간암에 미치는 영향에 대한 실험적 연구에 대한 보고는 우리나라에서는 아직 없었다.

이에 저자는 DENA와 CCl₄를 흰쥐에 병용 투여하여 간암 및 간경화를 유발시켰다. 다음으로 扶正抗癌湯 추출액을 체중 60 kg인 사람의 1일 투약량인 320 mg/kg (BHA군)과 2배에 해당하는 640 mg/kg(BHB군)으로 나누어 8주(이하 BHA-8군, BHB-8군)와 12주(BHA-12 군, BHB-12군) 동안 구강투여한 후 체중변화 관찰, Transaminase, Alkaline phosphatase, Lactate dehydrogenase, Alpha fetoprotein, SOD 추출 및 활성도, catalase 추출 및 활성도, 광학현미경 관찰, p53 면역조직화학, 전자현미경관찰 등을 수행하여 정상군, 대조군과 비교하였다.

일반적으로 종양 환자의 경우 현저한 식욕부진과 함께 탈수증상이 수반되며, 이로 인한 만성적인 체중감소가 초래되는데29), 체중측정 결과 간암이 유발되는 과정에서 대조군의 체중은 정상군에 비하여 4주부터 통계적으로 유의성 있게 감소하여 12주까지 계속되었다. 또한, 통계적인 유의성은 없었으나, 전반적으로 扶正抗癌湯 추출액이 투여된 실험군의 체중이 대조군에 비하여 모든 실험기간 동안 다소 높았다.

간질환을 인지하는데 있어 방사선검사와 더불어 혈청 검사가 널리 쓰이는데, 그 중 AST와 ALT는 간조직의 손상을 예측하는 좋은 지표가 된다. 또한 혈청 중에 검출 되는 ALP는 肝性, 骨性, 胎盤性, 小腸性이 있는데 성인에게서 볼 수 있는 것은 肝性인 경우가 많다. LDH는 惡 性腫瘍, 血液疾患, 心疾患, 肝疾患 등에서 血中에 높게 나타나며 진단의 실마리를 주거나 病態의 推移, 治療效果 의 판정에도 유용하다. 또한 肝癌에 있어 AFP의 지속적 상승을 기타 임상적 소견이나 방사선과적 소견과 병행하여 판독한다면 매우 높은 진단적인 가치가 있다30).

AST의 활성은 8주군에서는 정상군에 비하여 대조군은 통계적으로 유의성 있게 증가하였으며, 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 12주군에서도 AST의 활성은 정상군에 비하여 대조군과 BHB-12군은 통계적으로 유의성 있게 증가하였으며, BHA-12군은 다소 증가하였으나 유의성은 없었다.

ALT의 활성은 8주군에서는 정상군에 비하여 대조군에서 통계적으로 유의성 있게 증가하였다. 실험군인 BHA-8군은 정상군에 비하여 다소 높은 활성을 보였으며 특히 BHB-8군의 ALT 활성은 대조군에 비하여 통계적으로 유의성 있게 감소하였다. BHA-12군은 ALT 활성이 감소하였으며 BHB-12군은 효소 활성이 약간 증가 하였다.

ALP의 활성은 8주군에서 정상군에 비하여 대조군은 유의성있게 증가하였으며 BHA-8군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의성있게 활성이 감소하였다. 한편 BHB- 8군은 대조군에 비하여 감소하였다. 12주군에서는 정상군에 비하여 대조군과 BHB-12군 모두 통계적으로 유의성 있게 증가하였다. 실험군인 BHA-12군은 활성이 증 가하였다. 이로 보아 扶正抗癌湯을 8주 투여한 실험군에서는 扶正抗癌湯이 간 손상 회복에 효과가 있는 것으로 추정된다.

LDH의 활성은 8주군에서는 정상군에 비하여 대조군 에서 증가하여 통계적으로 유의성이 있었으며, 실험군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의성있게 감소하였다. 12주군에서 LDH의 활성은 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있게 활성이 증가하였으며, 실험군인 BHA-12군은 대조군에 비하여 감소하였고, BHB-12군은 통계적으로 유의성 있게 감소하였다.

혈청 AFP의 농도를 측정한 결과 8주군에서는 정상군에 비하여 대조군은 통계적으로 유의성있게 증가하였으며, 실험군은 대조군에 비하여 감소하였다. 특히 BHA-8군은 통계적으로 유의성 있게 감소하였다. 12주군에서는 대조군이 정상군에 비하여 AFP 농도가 7배정도 증가하였으며, 실험군인 BHA-12군과 BHB-12군은 대조군에 비하여 감소하였다.

이는 扶正抗癌湯을 8주 투여한 실험군에서는 扶正抗癌湯이 肝癌에 대한 항암효과가 뚜렷이 나타나며, 12주 를 투여한 실험군에서는 일정정도 효과가 있는 것으로 사료된다.

최근 SOD의 실험적 발생과 방어기전에 대한 연구가 많이 시도되고 있다. 높은 산소 분압이나 plumbagin, paraguat와 같은 화학물질에 의하여 세포내에서 superoxide radical 발생이 증가되면 세포에서 치사인자로 작용하며, 이때 SOD가 superoxide radical의 독성을 감소시켜 세포생존율이 증가되었다는 사실이 증명되었다31).

Catalase는 식물, 동물 등의 세포에 널리 있으며 특히 포유동물의 간, 신장에 농도가 높은 것으로 알려져 있다. 세포내에서 미토콘드리아와 peroxisome에 특히 많으며 세포내 소기관에서 H₂O₂의 농도를 조절하고 peroxidase 로서 작용한다32).

본 실험에서 SOD의 활성을 측정한 결과 8주군에서는 정상군에 비하여 대조군과 실험군 모두 증가하여 통계적으로 유의성이 있었으며, 실험군인 BHA-8군과 BHB-8 군의 활성은 대조군에 비하여 다소 감소하였다. 12주군에서는 정상군에 비하여 대조군은 통계적으로 유의성 있게 증가하였으며, 실험군의 활성은 대조군에 비하여 통계적으로 유의성 있게 감소하였다.

혈액내 catalase의 활성을 측정한 결과 8주군에서는 흰쥐의 정상군에 비하여 대조군에서 가장 낮게 나타났으며, 실험군은 정상군이나 대조군에 비하여 통계적으로 유의성 있게 증가하였다. 12주군에서는 정상군에 비하여 대조군의 활성은 감소하였으며, BHA-12군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의성 있게 증가하였다. BHB-12군은 정상군과 비슷하였다.

본 실험의 결과 대조군은 SOD 활성은 증가하였지만 상대적으로 catalase의 활성이 낮은 것으로 보아 간 손상이 심하게 진행되고 있음을 알 수 있었고, 扶正抗癌湯 추출액을 투여한 실험군에서는 SOD의 활성이 증가하면서 동시에 catalase의 활성이 증가하는 것으로 보아 간조직 내 활성산소와 과산화수소를 효과적으로 제거함으로써 간 손상으로부터 보호작용을 한다고 사료된다.

광학현미경으로 관찰 결과 8주 대조군은 중심정맥이 위축되어 있었으며 동굴모세혈관은 관찰되지 않았다. 중심정맥 주변 세포들에서는 세포질이 파괴된 간세포의 집단이 관찰되었다. 12주 대조군에서는 8주에 비하여 보다 많은 세포들이 호산성을 보여 주었을 뿐만 아니라간 조직 전반에 걸쳐 8주군에 비하여 간세포의 밀도가 증가하였다. BHA-8군은 비교적 타원형의 중심정맥을 중심으로 간 조직들이 구획화되어 결절 모양을 이루었다. 간 조직에서는 사염화탄소에 의하여 손상된 것으로 보이는 세포들이 관찰되었으며, 중심정맥에서 비교적 멀리 있는 세포들은 호산성을 띄고 있었다. BHB-8군은 타원형의 중심 정맥 주위는 염색성이 비교적 약하고 멀어질수록 강하게 나타났다. 호염기성을 보이는 커다란 핵을 갖는 간세포들이 다수 관찰되었다.

BHA-12주군의 간 조직은 비교적 둥근 중심정맥 주변에서 사염화탄소에 의해 손상된 조직들이 일부 관찰되었다. BHB-12주군은 비교적 불규칙한 형태의 중심정맥이었으나 동굴모세혈관은 뚜렷이 관찰되었다. 간 조직은 대 조군에 비하여 미약하지만 다수의 호산성세포들이 관찰되었다. 이러한 결과로 보아 扶正抗癌湯 추출액은 간암의 진행 및 세포손상을 억제할 것으로 사료된다.

p53 유전자는 세포주기에 작용하는 종양억제 유전자 의 하나로서 53kDo의 크기를 가지는 단백질이라 하여 명명되었으며, 인체 종양의 50~60 %의 높은 빈도로 발견되고 있다33-34). 이들 p53 단백질은 세포 내의 기능도 매우 다양하여 세포의 주기조절 세포고사 기전에 관여하고, 다양한 유전자들의 전사 조절 등의 역할을 수행하면서 세포 내 보호자 또는 감시인(guardian)의 기능을 수행 하고 있다. 또한 p53은 세포주기 억제 단백질인 WAF1/CIP1/p21과 KIP1/p27과 같은 유전자의 발현을 증가시켜 세포주기를 G0/G1 단계에서 멈추게 하여 조절을 하거나 또는 세포고사를 유도하는 것으로 알려져 있다 35-36).

p53 면역조직화학 관찰 결과를 살펴보면 8주대조군의 간세포에서는 중심정맥 주위의 간세포들에서 p53에 강한 면역반응성을 보여 주었을 뿐만 아니라 관찰되는 간 조직에서 고르게 분포되어 있었다. 12주 대조군의 간세 포에서는 p53 면역반응성은 세포질 보다는 핵에서 강한 반응성을 보여주었다. 면역반응성을 보이는 세포의 수는 8주 대조군에 비하여 증가하였다.

BHA-8군에서는 대조군에 비하여 p53에 면역반응성을 보이는 세포들의 수가 적었을 뿐만 아니라 면역반응성 또한 낮았다. BHB-8군은 대조군과 BHA-8군에 비해서 전반적으로 p53에 대하여 면역반응성은 미약하였다. BHA- 12군에서는 대조군에 비하여 면역반응성을 보이는 세포의 수는 소수였다. BHB-12군에서는 대조군에 비하여 미약한 p53 면역반응성을 보여주었을 뿐만 아니라 대부분 세포들이 정상적인 간 조직 소견을 보여주었다. 이는 실험군에서는 p53 면역반응성을 낮추어 간암세포의 분화도를 낮추며, 간암세포사멸을 촉진시키는 것으로 사료된다.

전자현미경 관찰 결과를 살펴보면 대조군 8주의 간세 포는 핵의 핵막이 둥글고 핵질이 고르게 관찰되었다. 과립세포질세망은 층판구조를 이루고 있었지만 발달은 미약하였으며 세포질에서는 세포소기관이 관찰되지 않은 영역들이 있었다. 대조군 12주의 간세포에서 관찰되는 핵의 핵막은 비교적 둥글게 관찰되었지만 내막과 외막이 뚜렷이 분리되어 있었다. 과립세포질세망은 내강이 매우 팽창되어 있었고 주위에서는 수많은 분비소포들이 집적되어 있었다.

扶正抗癌湯 추출액을 8주 동안 투여한 BHA-8군의 핵은 핵막이 둥글고 핵질이 고르게 발달해 있었으나 핵막은 내막과 외막이 분리되어 내강이 뚜렷하게 관찰되었다. 과립세포질세망은 내강이 매우 팽창되어 있었으며, 그 사이에서는 세장형의 사립체들이 다수 관찰되었으며, 다양한 크기의 분비소포들이 관찰되었다. BHB-8군의 핵은 핵막이 둥글고 핵질이 고르게 발달해 있었으며, 커다란 핵소체를 갖고 있었다.

扶正抗癌湯 추출액을 12주 동안 투여한 BHA-12군의 간세포는 핵의 핵막이 비교적 둥글고 내막과 외막이 다소 분리되어 있었다. 핵의 중앙에 커다란 핵소체가 있었다. 과립세포질세망은 비교적 층판구조를 이루고 있거나 산재해 있었는데 발달은 미약하였으며 내강은 다소 팽대되어 있었다. 세포질에서는 수많은 분비소포들이 집적되어 있었다. BHB-12군의 간세포는 외막과 내막은 약간 분리되어 있었으며 핵 주변에서는 세장형의 사립체들이 다수 관찰되었다. 과립세포질세망은 주로 층판구조를 이루고 있었는데 매우 발달해 있었으며, 내강의 팽대는 아주 미약하였다. 핵 주위 세포질을 포함한 여러곳에서 수많은 분비소포들이 관찰되었다. 이는 간암세포가 대조군에서는 실험군에 비하여 명확하게 관찰되었음을 의미하고, 扶 正抗癌湯이 간세포내의 신생물형성을 억제하고 있음을 시사한다.

이상의 실험결과들을 요약하여 보면, 扶正抗癌湯은 체중변화, LDH 측정, AFP 측정, p53 면역조직화학 관찰, 광학현미경 관찰, 전자현미경관찰 결과에서는 肝癌억제 효과와 간세포보호효과가 뚜렷하였다. AST 측정, ALT 측정, ALP 측정, SOD 측정 결과를 보면, 8주군에서는 일정정도 肝癌억제효과와 간세포보호효과를 나타냈다. 이는 扶正抗癌湯이 초기 간암과 간경변증에 더욱 효과가 있다고 유추해 볼 수 있다. 그러나 정확한 적정 투여량과 투여기간에 대한 유의성은 아직 불명확한바 이에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

扶正抗癌湯이 diethylnitrosamine과 CCl₄로 유발된 흰쥐의 간암 형성과 간경화에 미치는 영향을 규명하기 위하여 흰쥐에게 Diethylnitrosamine과 CCl₄ 처리 후 扶正抗癌湯 추출액을 320 mg/kg(BHA군)와 640 mg/kg (BHB군)을 8주(BHA-8군, BHB-8군)와 12주(BHA- 12군, BHB-12군) 동안 구강 투여하여 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 체중변화는 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있게 감소하였으며, 전반적으로 실험군의 체중이 대조군에 비하여 모든 실험기간 동안 다소 높았으나 통계적인 유의성은 없었다.

2. AST, ALT, ALP, LDH의 활성은 8주군에서는 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있게 증가하였으며, 대조군에 비하여 BHA와 BHB군에서는 감소하였다. 12주군에서는 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있게 증가 하였으며, LDH는 대조군에 비하여 실험군에서 유의성 있게 감소하였다.

3. 혈청 AFP는 8주군에서는 대조군이 가장 현저히 증가하였고, SOD의 활성은 대조군에서는 높고 BHA와 BHB군에서는 낮았으며 Catalase의 활성은 반대로 나타났다. 12주군에서는 혈청 AFP는 대조군에서 가장 높게 나타났으며, SOD의 활성은 대조군에서 가장 증가하였고 catalase의 활성은 증가하지 않았다.

4. 광학현미경 관찰 결과 8주군에서는 대조군에 비하여 실험군에서 간암의 발생과 손상이 미약하였으며, 12주군에서는 대조군에서 암세포의 밀도가 가장 높게 나타났다.

5. p53 면역조직화학 검사 결과 8주군에서는 대조군에서 대부분의 세포에서 p53-양성 반응이 나타났으며, BHB-8군에서 소수의 간세포에서 나타났다. 12주군에서는 대조군에서 대부분의 세포에서 발현되었으며, BHA-12와 BHB-12군에서는 소수의 간세포에서 나타났다.

6. 전자현미경 관찰 결과 대조군에서는 다수의 간암세포(hepatocarcinoma cells)가 관찰되었는데, 암세포는 매우 발달된 무과립세포질세망과 내강이 매우 팽대된 과립세포질세망을 갖고 있었고, 실험군에서는 암 세포의 수가 적었으며, 이들 세포소기관의 발달도 미약하였다.