최근 산업의 발달과 함께 약 80,000여개의 화학물질이 상업적으로 사용되고 있다. 각종 생물 및 생물화학적 물질 들의 국제교류가 활발해지고 이로 인한 각종 유해가능물질 (신종 마약류, 식품첨가물 및 산업환경화학물질) 등의 급격한 증가로 인한 면역계 이상으로 아토피성질환이나 알레르기성 질환이 증가되고 있다. 이러한 현상은 우리나라에서도 꾸준히 증가하고 있고 그 결과 영유아의 경우 유병율이 10%이상으로 추정되어진다.

아토피 피부염은 그 원인이 T 림프구의 면역학적 이상 이나 백혈구의 비면역학적 이상으로 추정되어지나 근본적 인 원인은 밝혀지지 않고 있다1). 다만 재발이 잦고 만성으 로 경과하기 쉬운 문명병적 염증성 질환이며 습진의 일종 으로 피부 소양증에 대한 역치가 낮아 심한 소양감을 유발 하고 이로 인한 2차적인 습진이 형성되는 질환이라는 점 에서는 이견이 없다2).

아토피 피부염 환자에게 있어서 소양증은 환자로 하여 금 병변을 반복적으로 긁게 하여 찰상과 태선화 등의 2차 적인 병변을 유발시킨다. 따라서 신속하게 소양증을 경감 시키는 것이 중요한 치료 목표가 되며 이를 위해 다양한 치료 방법들이 시도되고 있으나 치료에 잘 반응하지 않는 경우가 많다3).

스테로이드 외용제는 보습제, 식이 조절, 항히스타민제, 항생제와 함께 아토피 피부염의 치료에 흔하게 사용되어진다. 그러나 이를 장기간 사용했을 때 피부의 위축이나 소아 환자의 경우 성장 지연 가능성 등 각종 부작용이 문제되고 있어 새로운 치료에 대한 필요성이 증가되고 있다4).

이러한 필요성에 부응하는 천연물질 대체약물중의 하나 로 아로마 에센셜 오일(이하 에센셜 오일)이 이용되어져 왔으며 치료효능 역시 상당한 수준으로 알려져 있다. 인체 에 사용가능한 에센셜 오일은 약 300종 이상에 달하고, 그 중 60여종의 에센셜 오일이 이용되고 있다. 에센셜 오일 사용에 있어서 중요한 것은 혼합을 통한 시너지 효과로서 정신기능과 피부상태를 가장 효과적으로 발현시킬 수 있 다고 알려져 있는 몇 종류를 선택하여 시너지 효과를 극대 화하는 것이다. 일반적으로 2~3가지 이상의 오일을 혼합 해서 사용하는 것이 치료효과를 가장 극대화 시키는 것으 로 알려져 있다5).

라벤더(Lavendula angustifolia)는 지중해의 토착식 물로 linalyl acetate 등의 에스테르와 linalool의 알코올 이 주요 성분으로 에스테르는 신경계를 안정시키고 강화 시키는 특성이 있어 항진균제, 진정제 효과가 있다6). 레몬 (Citrus limon)은 대부분 모노테르펜 탄화수소물인 limonene 성분으로 구성되어 있는데, 모노테르펜은 진통, 항바이러스, 충혈완화, 강장제, 흥분제과 호르몬 같은 성질을 갖고 있다7). 유칼립투스(Eucalyptus globulu)는 에센셜 오일에 함유된 옥사이드 성분 중 대표적인 것은 eucalyptol (1.8-cineole)이다. 1.8-cineole은 호흡기계 와 소화기계를 자극하며, 가래를 녹이거나 기관지에 발생한 질병에 효과적인데 유칼립투스 외에 티트리, 로즈마리 등의 에센셜 오일에도 다량 존재한다8).

이러한 기존 지식에 근거하여 본 연구에서는 라벤더, 레 몬, 유칼립투스 등 3종류의 에센셜 오일을 혼합하여 아토 피 피부염이 유발된 쥐를 대상으로 소양증 등 아토피 치료 가능성을 검중하기위해 이들 세 가지 에센셜 오일들을 캐 리어 오일인 조조바 오일(Jojoba Oil)과 섞어 혼합 오일을 만든 다음 12주령의 발진된 NC/Nga 생쥐의 등 부위에 도포하여 임상적 변화, 혈청 중 IgE, clinical score, IgG1, 싸이토카인(IL-4, IL-13 및 IFN-γ) 발현 등을 분 석하여 아토피 발진 억제에 미치는 영향을 살펴보았다.

1) 동물

실험동물로써 6주령의 수컷 NC/Nga mice는 Japan SLC사에서 공급 받아 실험당일까지 고형사료(항생제 무 첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 22±2℃, 55±15%, 12시간-12시간 (light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

2) 약물

실험에 사용한 에센셜 오일들은 Eucalyptus (Eucalyptus globulus), Lemon (citrus limon), Lavender (lavandula angustifolia)이며 캐리어 오일(Carrier Oil)로 조조바 (Jojoba Oil)를 사용하였다. 오일 배합 비율은 통 상 사람의 경우 (60kg 기준으로 사용시) 1.5%인 것을 감 안하여 쥐의 무게를 환산하여(20g 기준으로, 0.025%) 배 합한 후 실험에 사용하였다. 실험에 쓰인 오일은 Essenjoy (네이쳐- 프러스, 한국)가 생산한 것들이다.

3) 시약 및 기기

본 실험에 사용된 시약 중 dinitrochlorobenzene (DNCB), collagenase, trichloroacetic acid, trypsin- EDTA, SRB, acetic acid, tris-base, aceton, olive oil, ethanol, DNase-1, dNTPs, RNase inhibitor, tris- HCL, RPMI-1640 배양액, 적혈구 용혈액 (RBC lysis solution), ethidium bromide (EtBr), dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), formaldehyde는 Sigma사 (U.S.A.) 제품을 사용하였으며, 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)은 Hyclone사 (U.S.A.) 제 품을, Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-13 (IL-13), Interferon-γ(IFN-γ)는 R & D system사 (U.S.A.) 제품을 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.

기기는 Microwave oven (LG, Korea), CO2 incubator(Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench(Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo,Co., Japan), micro-pipet (Gilson, Co., France), waterbath (Vision scientific Co., Korea), vortex mixer(Vision scientific. Co., Korea), centrifuge (Sigma,Co., U.S.A.), homogenizer (OMNI, Co., U.S.A.),plate shaker (Lab-Line, Co., U.S.A.). ELISA reader(Molecular Devices, Co., U.S.A.), Applied Biosystems7500 Fast Real-Time PCR system (AppliedBiosystems, Co., U.S.A.), contrast fluoroseince microscope(Nikon, Japan) 등을 사용하였다.

1) 시료 조제

에센셜 오일은 Eucalyptus (Eucalyptus globulus), lemon (Citrus limon), lavender (Lavandula angustifolia) 오일을 1:2:2 방울로 배합하여 캐리어 오일인 조조 바 오일 50ml에 희석하여 100㎕ (0.025%)를 사용하였다. 오일은 차광병에 넣어 상온에서 빛이 통하지 않게 보관하여 실험에 사용하였다.

2) 세포독성 측정

(1) Mouse Lung Fibroblast cells (mLFCs) 배양

BALB/c 생쥐의 폐 조직을 cool D-PBS로 3회 세척한 후 작은 조각으로 절단한 다음, conical tube (15㎖)에 넣 어 1,400rpm에서 5분간 원심분리하였다. Tube에 다시 DMEM {containing collagenase A (5mg/㎖, BM, indianapoilis, IN, U.S.A.)와 DNase type Ⅰ(0.15 mg/㎖, Sigma), antibiotics(penicillinm 104U/㎖, streptomycin 10mg/㎖, amphotericin B 25㎍/㎖)}를 넣고 37℃ CO₂ 배양기에서 2시간 동안 배양한 후 0.5% trypsin-0.2% EDTA를 첨가하여 30분간 계속 배양하였다. 배양 후 인산완충생리식염수로 약 2회 1,500rpm에서 원심분리한 후 DMEM-10% FBS에서 1주일 동안 배양하였다. 1주일 후 0.5% trypsin-0.2% EDTA로 mLFC 세포를 분리한 후 DMEM-5% FBS 배양액에 105cells/㎖ 농도로 96well plate에 분주하였다.

(2) SRB assay

세포 독성 측정 방법은 SRB assay법을 약간 변형하여 실험에 사용하였다. mLFCs 세포는 37℃, 5% CO₂ 배양 기에서 1시간 배양한 후 ELL을 D-PBS에 현탁하여 최 종 농도 0.025, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10%를 48시간 동안 처리하였다. 배양 종료 후에 배양액을 버리고 D-PBS로 2 회 세척하였다. 각 well에 50% TCA (trichloroacetic acid)를 50㎕를 가하고 1시간 동안 4℃에 방치하였다. 이 를 다시 증류수로 5회 세척한 다음 well plate를 공기 중 에서 건조하였다. 여기에 SRB (0.4%/1% acetic acid) 용액을 100㎕/well로 가하고 실온에서 30분간 염색하였 다. 그리고 0.1% acetic acid 용액으로 약 45회 세척한 다음 공기 중에서 건조하고 10mM Tris Base로 100㎕/well로 용해시켰다. 이 plate를 plate shaker (Lab- Line, U.S.A.)에서 3.5speed로 5분간 shaking하고, ELISA reader (Molecular devices, U.S.A.) 540㎚에 서 흡광도를 측정하였다.

3) 피부염 유도 및 시료 처리

11주령이 된 NC/Nga 생쥐의 등 부위를 깨끗하게 제모 한 후 제모가 끝나면 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시 간 방치하였다. 그리고 1% Dinitrochlorobenzene (DNCB) 용액 (아세톤:올리브오일=3:1) 200㎕를 등 부위 에 도포하였고, 4일 후, 1주일에 2-3번씩 0.2% DNCB 용 액 150㎕를 등 부위에 도포하였다 (12주부터 20주).

이렇게 8주 처리한 다음 피부염이 충분히 유발되어 등부위의 가피가 모두 벗겨지고, 이 부위에 새로운 피부염이형성되면서 긁는 행동이 심화되면 DNCB 처리를 중단하고, 관능 평가를 실시하였다.

4) 관능평가

DNCB를 도포하여 피부염이 유발된 생쥐를 2개의 그 룹으로 나누고, 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 ELL을 (0.025%/100㎕/day)을 8주간 (12주에서 20주까지) 도포하였다. 도포한 후 일반적으로 사용되어지는 임상 육안적 방법으로 관능 평가를 4주 간격으로 실시하였다25). 육안 평가 결과는 다음의 5가지 항목을 각각 평가한 점수 의 총 합으로 나타내었다. 평가 항목은 홍반 (erythema), 가려움과 건조 피부 (Pruritus & Dry Skin), 부종과 혈종 (Edema & escoriation), 짓무름 (Erosion), 그리고 태선 화 (Lichenification)로 나누었다. 이 각각의 항목은 없음 (0), 약함(1), 중증도(2), 심함(3)으로 채점하였다. 일반적으로 DNCB를 이용해 피부염을 유발할 경우, 약 12-13점이면 피부염이 최고조에 달했다고 판단한다.

5) 사이토카인 생성량 측정

(1) 비장 세포 배양액의 사이토카인 측정

Spleen cell (2x10⁶/mL)을 anti-CD28 (1μg/mL)과 anti-CD3 (1μg/mL)으로 24-well Costar 접시 (Corning Inc, Cambridge, Mass)에서 coating하여 48시간 동안 동시 배양 한 후, Interleukin-4(IL-4), Interleukin-13(IL-13), Interferon-γ(IFN-γ) 생성량을 ELISA kit로 측정하였다.

Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. 염증 사이토카인 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix (ABI)를 사용하였고, internal standard를 G3PDH를 사용하였으며, primer의 최종 농도가 200nM이 되게 반응시켰다.

Pre-denaturation은 2min at 50℃, 10min 94℃, 그 리고 40 cycles을 0.15min at 95℃, 1min at 60℃에서 수행하였다. ELL 투여군과 대조군은 internal standard 로는 G3PDH를 사용하여 target group의 Quantitative PCR로 계산하여 RQ (relative quantitative)을 측정하 였다.

y = x(1+e)n

(x = starting quantity, y = yield, n = number of cycles, e = efficiency)

6) 면역글로불린 측정

시료 투여 시점인 8주와 12주, 16주, 그리고 20주에 생 쥐의 눈에서 capillary tube를 이용하여 약 100㎕의 혈액 을 채혈한 후 원심분리기 6,500rpm에서 20분간 원심분리 한 후 30㎕의 혈청을 분리하였다(IgG1은 IgE 상승을 확 인한 것으로 20주차에 단회만 측정함). 혈청은 취하여 실 험에 이용할 때 까지 -70℃에 냉동 보관하였다. 혈청내 IgE, IgG 측정은 Enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA, Endogen, USA)와 ELISA kit (R&D system)를 사용하였다. 각 항체를 coating 완충 용액에 희석하여 microwell에 coating한 후 4℃에서 overnight 하였다. 각 well을 3회 washing 완충 용액으로 세척한 후 폐포 세척액과 혈청(100배 희석)을 100㎕씩 분주하였다. 이를 1시간 동안 실온에서 방치한 후 washing 완충 용액 으로 2회 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugeted 100㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세 척하였다. 여기에 TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 50㎕의 stop 용액을 처리하고 ELISA reader 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

7) 통계처리

다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean±standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's T-test 분석 법을 이용하여 결정하였다.

본 실험에서 ELL의 아로마 오일이 정상세포에 미치는 영향을 SRB법으로 측정하여 안정성 여부를 관찰하였다. mLFCs을 96well plate에 5x10⁴ 세포로 분주하여 subculture 한 후 Eucalyptus, lemon, lavender와 이것을 혼합한 ELL을 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10%의 농도로 48시 간 동시 배양한 후 SRB법으로 세포독성을 분석한 결과, 시료를 처리하지 않은 상태인 대조군의 세포생존율은 100.0±5.2(%)로 나타났다. 한편 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10%의 농도로 처리한 실험군은 각각 대조군에 비하여 처리한 0.5%이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다 (Fig. 1).

본 실험에서 ELL의 아토피 피부염 억제 작용을 조사하 기 위하여 Nc/Nga 생쥐를 이용하여 조사하였다. DNCB 를 제모한 피부에 도포하여 피부염을 유발하였으며, 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 ELL 0.025%의 농도로 매일 도포하여 피부염 지수를 측정하였다. Fig.2에서 보는 바와 같이 DNCB를 NC/Nga mouse에 8주간 도포하 고 최종 등피부에 나타난 소양행동을 동반한 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 단계를 0(none), 1(mild), 2(moderate), 3(severe)로 개체마다 평가 기록하여 피부 발진 점수로 평가한 결과 대조군의 skin clinical score는 DNCB를 도포하지 않은 정상군 (NC/Nga-Nr)에 비하여 10배 이상 skin clinical score 값이 증가하였고 ELL 도 포군은 대조군에 비해 3배 이상 유의성 있게(p<0.001) 감 소하였다(Fig. 2).

본 실험에서 ELL이 Th2 cell에 관여하는 IgE와 IgG1 의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 NC/Nga 생쥐 의 눈에서 혈액을 채혈한 후 혈청을 분리하여 생성량을 측 정한 결과, IgE와 IgG1 생성량은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소를 나타내었다(Fig . 3).

본 실험에서 ELL의 사이토카인 생성 조절 작용을 보 면, Th2 사이토카인에 대하여는 비장 세포 배양액 중의 IL-4와 IL-13 생성이 억제 된 것을 확인할 수 있었다. Th1 사이토카인에 대하여는 비장 세포 배양액 중의 IFN-γ생성이 유의성 있는 증가를 확인할 수 있었다.

현재 전 세계적으로 수많은 사람들이 아토피성 피부질 환으로 고통 받고 있으며, 아토피 피부질환은 주로 유아 와 소아에 발생하는 만성적 또는 재발성 염증 피부질환으 로9.10), 아직까지 정확한 원인을 규명하지 못하고 있다. 아 토피피부염은 유전적인 가족력과 음식섭취 등으로 인한 생활·환경의 영향과 파괴된 피부층을 통해 유입된 항원 물질에 대한 면역반응으로 혈중 IgE 항체의 수준이 증가 함으로써 나타나는 복합적 질환으로 알려져 있으며11-12), 만성 재발성 습진 질환으로 유전학적 요소, 환경 요소, 피부장벽의 이상과 면역반응의 이상이 함께 작용하여 피부의 습진성 변화, 심한 소양증과 함께 이차적인 태선화를 일으킨다. 아토피피부염의 병인은 정확히 밝혀지지 않았으나 피부의 면역 반응의 이상이 주요한 기전으로 생각되 고 있으며 과민 반응을 보이는 T 세포, 높은 친화력을 가 진 IgE 수용체를 발현하는 수지세포(dendritic cell), Th1과 Th2의 불균형과 선천성 면역의 이상 등이 주요한 원인으로 여겨지고 있다. 원인을 규명하고자 하는 학술 적 노력보다도 더 현실적인 것은 중등도 이상의 아토피피 부염은 사회적, 경제적, 정신적인 측면에서 환자의 삶의 질을 현저하게 떨어뜨린다는 사실이다. 아토피피부염의 증가로 자연친화적인 생활양식에 대한 관심과 요구가 높 아지면서 최근에는 자연치유요법에 대한 관심과 이를 실제 임상에 적용하려는 여러 종류의 대체요법들이 새롭게 부각되고 있다. 그러한 방법들 중의 하나로서 아로마테라피는 그 효능성과 접근성 및 편리성에서 가장 대중적인 대체요법으로 자리 잡고 있다. 이러한 관점에서 본 연구 에서도 아로마를 이용한 아토피 질환 억제효과를 규명하고자 하였다. 구체적으로 아토피질환환자의 피부발진과 유사하게 항원에 의하여 피부질환을 유도하는 동물실험 모델을 사용하여 ELL을 도포하여 효능을 알아보았다. 피부질환환자와 같은 발진유발을 위하여 DNCB를 알러젠으로 반복 도포하여 NC/Nga 생쥐를 아토피피부발진동 물모델로 사용하여 ELL의 피부발진억제 효과를 관찰하 였다. 우선 아로마 오일의 독성검사를 실시하였다. 독성 이 있는 물질은 세포의 증식·분화·기능을 저해하고, 세포분열을 할 때 염색체 복제 이전 단계에서 염색체의 활 성을 억제한다고 알려져 있다13). SRB assay는 세포 단백질 염색을 이용하여 세포증식이나 독성을 측정하는 방법으로14) 아로마 오일인 유칼립투스, 레몬, 라벤더와 이것을 혼합한 ELL오일에서는 독성이 없음을 나타내었고, 임상 피부평가 수치 (skin dryness, erythema, edema, erosion) 에서는 효과적으로 피부염 수치를 감소시켰다.

Mouse 면역 시스템에 관련이 있는 세포 중에 두 종류 의 helper T cell (Th)있다. 그리고 이들 세포들이 생산 하는 cytokine의 종류에 의해 다시 Th1과 Th2 등의 subtype으로 분류되어 진다15). 이중 아토피는 Th2의 활 성화에 기초를 둔 면역 시스템 이상반응으로 특징지어진 다. 즉, 미분화된 Th cell이 Th2로의 분화가 과다 촉진되면서 발생되기 시작한다고 알려져 있고, 이때 Th2 cell 은 IL-4, IL-5, IL-13, IL-9과 IL-10 등과 같은 cytokine을 생산하게 되고16), 이중 IL-4와 IL-13은 mouse에서 IgE와 IgG1의 합성을 촉진하는 것으로 알려져 있다17). 아토피는 Naive T cell에서 Th2 cell로 분화되고, Th1은 Th2가 생산하는 IL-4등의 cytokine의 자극으로 Th에서 Th1으로 전환되어져야한다. 그러나 전 환되지 못하고, 이 과정에서 Th2에서 생산된 IL-4, IL- 5, IL-9 및 IL-13등의 cytokine에 의해 B cell에서 IgE 생산을 촉진하고 비만세포 (mast cell)를 탈과립화시키고, 호산구(eosinophil)등을 활성화 시켜 혈액 내 IgE의 함량이 증가와 histamine과 같은 cytotoxic 물질들의 농도가 증가하면서 각종 염증 반응들이 진행되는 것으로 알려져 있다18). Th2 cell의 경우 IL-4, IL-5, IL-13과 같은 cytokine만을 특이적으로 발현하며, 이러한 Th2 cell의 경우 eocinophil의 증식시켜 mast cell과 basophil을 자 극하여 세포내에 수용성 물질의 방출을 유도한다. 그리고, B cell이 isotype switching을 유도하여 IgE나 IgG1과 같은 면역글로불린의 분비를 촉진시킨다19). ELL 은 이러한 면역글로불린의 분비를 대조군보다 현저하게 감소시켰다.

최근 연구에서도 Th1세포와 Th2 세포는 각기 특징적 인 싸이토카인의 발현을 통해 서로 상반되는 면역기능을 담당한다. Th2 cell 경우 IL-4, IL-5, IL-13과 같은 cytokine만을 특이적으로 발현하며, 이러한 Th2 cell의 경우 eocinophil의 증식시키며 mast cell과 basophil로 하여금 세포내에 수용성 물질의 방출을 유도하는 것으로 알려져 있다19).

또한, Th1 세포의 경우 특이적으로 IFN-γ, TNF-α, IL-2와 같은 싸이토카인을 발현하며 pro-inflammatory 혹은 cell-mediated immune response를 담당하고 있 다20), 이러한 Th1 세포는 면역계에서 CD8 T+ 세포를 활성화 시키고, macrophage의 활성화 및 DTh에 중요 기능을 담당하고 있다. 또한 B 세포를 자극하여 IgM, IgG2a, IgG2b와 같은 항체를 특이적으로 생산하도록 유도한다고 알려져 있고21), ELL의 Th1세포와 Th2 세포 는 각기 특징적인 싸이토카인의 발현을 확인할 수 있었 다. 이상의 결과로 미루어 ELL은 인체에서도 Th1세포 와 Th2 세포의 조절 및 IgE 생성량 억제를 통하여 항아 토피 효능을 발휘할 수 있을 것으로 추측되며 이를 위한 임상연구가 활발히 이루어져야 할 것으로 생각된다. 또 이를 위하여 에센셜 오일들 간의 최적 배합에 대한 보다 심도 있는 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.

아토피질환 환자의 피부발진을 DNCB의 항원을 반복 도포하여 동물실험모델을 만들어 ELL의 효능검사를 실시한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. ELL의 아로마 오일은 0.5%이하의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.

2. ELL이 아토피 피부염 억제 작용에서 임상스코어상 피부염을 대조군에 비하여 유의성 있게 감소시켰다.

3. ELL이 혈청 면역글로불린 IgE와 IgG1 생성량을대조군에 비하여 유의성 있게 감소시켰다.

4. ELL이 Th2 사이토카인인 IL-4와 IL-13 생성량을 유의성 있게 억제시켰고 Th1 사이토카인인 IFN-γ생성 량을 유의성 있게 증가시켰다.

이상의 결과에서 라벤더, 레몬, 유칼립투스 혼합 에센 셜오일은 Th2 관련인자의 조절을 통해 아토피 피부염 유발 동물모형에 대해 효과가 있을 것으로 추정된다.