각막은 안구의 외막 중 앞쪽 1/6을 차지하며 영양공급 은 각막윤부의 풍부한 혈관망과 전방수, 누액 등에서 공급 받는다. 각막표면은 대부분의 산소를 대기로부터 얻는데, 안구표면의 최전단에 위치하므로 외부에 노출되어 쉽게 손상이나 감염이 발생되고, 질이 투명하여 경미한 병변도 쉽게 각막의 투명성을 손상시켜 그 정도가 다른 혼탁을 형 성하여 쉽게시력장애를 일으킨다1). 정상각막은 눈꺼풀, 속 눈썹, 눈물의 세척작용으로 세균감염으로부터 일차적으로 방어되며, 눈물의 항균성분이 세균감염을 방지하는 등의 생리적 방어기능을 갖는다2). 그러나 면역기능저하, 저항력이 떨어진 경우, 피로도 또는 외상 특히 콘텍트랜즈의 착 용으로 인하여 각막표피가 벗겨진 경우에 실질에 침범하 여 질환을 유발시킨다3).

각막염은 각막에 생기는 염증성 질환으로 폐렴구균, 포 도상구균, 연쇄상구균, 녹농균, 진균 등에 의해 유발되며4), 세균은 Staphylococcus, Pseudomonas aeroginosa, 진균은 Fusarium이 가장 많다5).

한의학적으로 聚星障, 凝脂, 花白陷등의 질환이 각막염에 해당된다6). 黑睛에 미세한 星點狀의 混濁이 나타 나서 한 부위에 聚合되는 것을 聚星障, 聚星障이 심해지면 凝脂, 花白陷등 黑睛에 궤양을 형성하게 된다6,7). 궤 양의 형성은 시력장애를 유발하거나, 심하면 실명을 일으 킬 수도 있다.

각막의 치료에 있어서, 각막에는 혈관분포가 없기 때문 에 내복제보다는 항생제를 국소 점안하는 것이 약물침투 에 용이하다8). 점안제는 각막내 높은 농도를 유지하여 세 균이나 세균에서 나오는 여러 가지 독소와 효소를 씻어내 는 효과가 있어서 유리하므로9) 서양의학에서는 안과질환 에 대한 외용 점안약의 사용이 일반적으로 보편화되어 있 다10). 이에 반해 한의학에서는 점안약의 사용이 일반화 되 어 있지 않으며, 지금까지의 연구도 미미한 실정이다8,11). 따라서 한의학에서도 효과성과 안정성을 담보할 수 있는 점안약에 대한 다양한 연구가 필요하다고 사료된다.

이에 본 연구에서는 각막염을 치료하기 위한 목적으로 대한약침학회에서 제조된 알코올 수침법을 이용한 제제 중에서 淸熱解毒과 明目의 효능으로 目赤腫痛, 羞明, ？障을 치료12)하는 것으로 眼病의 外治法에 多用된 熊膽의 약침액을 점안제로 활용하기 위하여 각막염 유발균 6종에 대하여 억제환 및 최소 성장 억제 농도 측정 시험을 시행 하여 그 결과를 보고하는 바이다.

1) 균주 및 사용배지

본 실험에 사용한 균주는 한국생명공학연구원에서 분양 받은 것으로, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa는 Trypic Soy Agar 배지에서, Aspergillus niger는 Malt Extract Ag-ar 배지에서, Fusarium oxysporum는 Potato Dextrose Agar 배지에서, Candida albicans는 Yeast Mold Agar 배지에서 각각 배양하였다.

실험에 사용된 웅담약침액은 대한약침학회에서 다음과 같은 방법에 의하여 제조된 것을 사용하였다.

1) 웅담약침액 제조방법

웅담을 정량하여 증류수에 하루정도 침전시켜 모두 녹 인 후 용매 알코올을 이용하여 추출한다. 웅담 농축액의 양 을 측정하여 alcohol 90%를 첨가하여 magnetic stirrer로 3시간 이상 교반한 후 둥근 플라스크에 교반액을 넣고 감압 농축한다(온도:65℃, vacuum:15정도 설정, 약 5℃의 냉 각수). 90% alcohol 감압농축액의 양을 측정하여 alcohol 80%로 조정한 후 3시간 이상 교반한 후 둥근 플라스크에 교반액을 넣고 감압 농축한다. 80% alcohol 감압농축액의 양을 측정하여 alcohol 70%로 조정한 후 3시간 이상 교반 한 후 부후너 깔대기로 여과하여 여액을 감압 농축한다. 적 당량의 증류수를 첨가하여 재감압 농축한 후 0.1㎛ 여과지 ('whatman, Germany)까지 여과한다. 재감압 농축이 완 료된 여액을 동결건조기용 플라스크에 나누어 -30℃ 정도 에서 예비동결한 후 동결건조기(PVTFD10A, ilshin lab, Korea)에서 건조한다(동결 건조된 웅담 분말은 평균적으 로 100g 당 60~70g이 얻어진다). 얻어진 동결분말을 이용 하여 3㎎/㎖의 농도로 웅담약침액을 제조한다.

2) 억제환(Inhibition zone) 및 최소 성장 억제 농도 (Minimum Inhibition Concentration, MIC) 측정

(1) 접종원의 준비

① 세균과 효모는 -80℃에서 동결보존된 시험균주를 영 양배지에서 37℃로 24~48시간 배양하여 소생시킨 후, 이중 한 콜로니를 20㎖의 Tryptic Soy broth로 옮겨 37℃에서 120rpm으로 18~24시간 진탕배양 한다.

② 배양 후 OD(Optical Density) 값을 측정하여 각각 의 균수를 1~2×108/㎖가 되도록 멸균 생리식염수 로 희석하여 접종원으로 사용한다.

③ 곰팡이는 25℃에서 포자가 충분히 생성될 때까지 배 양한다.

④ 곰팡이의 포자를 0.2% Tween 80이 첨가된 생리식 염수 10㎖로 포집하여 충분히 진탕한 뒤, 현미경으로 관찰하여 포자수가 1~2×108/㎖가 되도록 희석하여 접종원으로 사용한다.

(2) 항균활성 탐색

① 준비된 접종원을 각각의 적정배지에 100℃씩 접종하 여 도말한다.

② 도말된 배지 상에 일정 간격으로 filter disc 혹은 cylinder cup을 올려놓고 3㎎/㎖ 농도의 웅담약침액 50℃(cylinder cup에는 150℃)를 적하한다.

③ 위의 배지를 조심스럽게 sealing하여 세균과 효모는 37℃에서 1~2일, 곰팡이는 25℃에서 일주일간 배 양하여 나타난 억제환의 크기를 측정한다.

④ 최소생육저지 농도를 결정하기 위하여 3㎎/㎖ 농도 의 웅담약침액을 적정비율로 단계적으로 희석하여 1~3의 과정을 반복 실험한다.

⑤ 항균제 효과를 비교하기 위하여 Levofloxacin(5㎎) 제제의 점안약 Cravit(제일제약)를 검액과 같은 농도 로 실험하였다.

1) Staphylococcus aureus KCTC 1916

웅담약침액은 50℃ 농도에서 억제효과가 나타나지 않 아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 1).

2) Staphylococcus epidermidis KCTC 1917

웅담약침액은 50℃ 농도에서 억제효과가 나타나지 않 아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 2).

3) Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004

웅담약침액은 50℃ 농도에서 억제효과가 나타나지 않 아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 3).

4) Aspergillus niger KCTC 6906

웅담약침액은 50℃ 농도에서 억제효과가 나타나지 않 아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 4).

5) Fusarium oxysporum KCTC 16322

웅담약침액은 50℃ 농도에서 억제효과가 나타나지 않 아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 5).

6) Candida albicans KCTC 7965

웅담약침액은 50℃ 농도에서 억제효과가 나타나지 않 아서, 항균효과가 보이지 않았다(Fig. 6).

각막은 안구의 외막 중 앞쪽 1/6을 차지하는 투명한 무 혈관 조직이며 각막상피, 보우만층, 각막간질, 데스메막, 각막내피의 5개의 층으로 이루어져 있고, 보우만층은 일 단 파괴되면 재생되지 못하고 반흔을 만들게 되어1), 시력 장애 및 시력상실을 유발할 수 있다.

감염성 각막염은 가장 흔하고 중대한 안감염으로서 현 재 계속 증가하는 추세에 있으며13), 각막염은 세균성, virus성, 진균성의 순으로 많이 발생한다1). 이 중에서 세균 에 의한 각막염이 모든 미생물 감염의 65~90%를 차지하 는 것으로 알려져 있으며2), 외상이나 콘택트렌즈 착용으로 인한 저산소 손상, 혹은 만성적인 안구표면질환 등으로 인 해 정상적인 각막의 방어기전이 작용하지 못할 때 발생하 게 된다11).

세균각막염을 유발하는 주된 원인균인 Staphylococcus species14)는 Gram양성균으로 건조에 대한 저항력이 강하여 건조된 물질에서도 수 개월간이나 살아있으며, 또 함수탄소, 단백질, 지방 등을 모두 영양분으로 이용할 수 있어서 신체의 어느 부위에서도 살 수 있다15).

Staphylococcus aureus에 의한 각막염은 흔히 경계가 비교적 명확한 회백색 또는 미색의 간질 침윤으로 나타나 며16), 각막염을 가장 심하게 일으키는 균으로 알려져 있다 17). Staphylococcus epidermidis는 미세구균과의 그람 양성 구균으로 주로 피부 및 안부속기, 호흡기 계통에 존 재하는 정상 세균총이면서 인공 보형물과 관련된 감염을 주로 일으키고, 안과적으로는 안검결막염, 각막염, 안내염 등을 일으킨다17).

Pseudomonas aeruginosa은 감염성 각막염의 중요한 원인균으로서, 급속히 각막조직의 파괴를 일으키며18), 심 한 전방축농을 동반하고 궤양부의 삼출물과 침윤 부위가 세균의 생산 색소에 의해 특징적인 청록색을 띠기 때문에 녹농균 각막궤양이라 한다19). 이 세균은 우리가 많이 접하 고 있는 콘택트 렌즈, 안약이나 화장품 등 유기 탄소가 포함된 물질이면 어디든지 있을 수 있어 정상적인 방어기전이 저하되어 있을 때 각막에 침입하여 각막염을 일으킨다20).

진균 각막염은 세균각막염에 비하여 발생빈도는 낮으 나, 최근 20~30년 간 현저히 증가되고 있다13,16,21). 진균의 역학적 분포는 주로 기후와 큰 연관이 있으며, 전세계적으 로 가장 흔히 각막염을 유발하는 진균은 Aspergillus로 알려져 있다22). 점안용 광범위 항생제 사용의 증가는 진균 이 용이하게 성장할 수 있는 환경을 제공하고 있으며, 점 안용 부신피질호르몬제의 사용은 인체의 면역기능을 억제 시켜서 진균의 성장을 촉진하게 된다16). 진균은 심한 각막 궤사를 일으키고 정상의 데스메막을 뚫고 전방에 들어갈 수가 있다. 한번 전방에 침투하면 항진균제가 침투력이 약 하므로 염증을 조절하기가 매우 힘들다23). 대부분의 진균 은 자연에 산재되어 존재하며, Aspergillus나 Fusarium 같은 사상진균에 의한 각막염은 식물에 의한 각막외상 후 발생할 가능성이 많으며, Candida같은 효모는 스테로이 드를 장기간 점안하거나 면역력이 감퇴된 각막에서 흔히 각막염을 일으킨다24).

Aspergillus나 Fusarium같은 사상진균에 의한 각막염 은 초기에는 미세하거나 거친 과립상의 침윤이 상피와 표 층간질에 존재하며, 각막상피 표면은 건조하고 거친 느낌 을 주며 회백색을 보인다. 심하지 않은 경우의 각막간질 침윤 주위에는 미세한 깃털 모양의 분지된 균사가 관찰 가 능하고, 위성병소(satellite lesions) 및 화농성 미세농양 (microabscess), 면역환(immune ring), 전방축농, 내피 세포의 반흔(endothelial plaque)등이 나타나기도 한다. 이에 비해 Candida같은 효모에 의한 각막염은 가장자리 의 경계가 분명하고 각막간질의 황백색 화농을 가진 작은 난원형 궤양을 흔히 일으키며, S. aureus 혹은 S. pneumoniae 각막염 같은 그람 양성 세군각막염과 아주 유사 하게 나타난다16,21,23).

각막염의 치료는 원인균을 제거하고, 염증반응을 억제 하며, 정상적인 각막의 구조를 회복시키는데 있으며2), 성 공적인 치료를 위해서는 약제의 적절한 투여방법이 필요하 다25). 안과적 치료에 있어 항생제의 전신적 투여는 각막에 도달하는 농도가 충분하지 못하고 다량 사용시 간기능 저 하가 유발될 수 있으며, 또한 내성을 가진 균주의 출현도 문제가 되고 있어26), 점안제가 가장 흔히 사용되고 있다27).

한의학에서는 안과 질환을 치료하는 방법으로 한약을 복용하는 內服藥法과 外治法인 外用藥法이 있는데28), 점안 법은 膏劑, 散劑, 藥水등의 형태로 눈에 직접 작용시켜 치 료하는 외치법을 말한다29). 안질환에 사용할 수 있는 가장 적절한 외치방법은 點法과 適法이 있으며, 이 중 適法이 현재 사용하기에 가장 적절한 방법으로 소개되고 있다30). 點法은 약물을 극도로 細末하여 粉末로 만들어 지금의 棉 簽, 즉 면봉을 활용하여 점안하는 방법으로 자극이 없어야 하며, 滴法은 약물을 煎湯하여 液汁을 만들고 藥液을 澄淸 濾過하여 患眼에 滴入하는 방법이다28,31). 適法의 활용도는 點法과 동일하여 胞瞼, 兩瞼 , 白睛, 黑睛에 발생한 紅赤, 腫脹, 或乾結, 生, 膜, 星, 努肉및 痛痒羞明, 沙澁不？ 등의 外障眼病과 기타 소수의 瞳神및 안내부 조직의 黃精, 神膏, 視衣, 目系에 발생한 蚊蠅飛舞, 黑花飄蕩, 視火如彩虹, 視物昏朦, 夜盲, 甚則?盲등의 內障眼病에 응용할수 있다30).

이에 본 연구에서는 염증성 안질환을 치료하기 위한 목 적으로 대한약침학회에서 제조된 알코올 수침법을 이용한 제제 중에서 淸熱解毒과 明目의 효능으로 目赤腫痛, 羞明, 障을 치료12)하는 것으로 眼病의 外治法에 다용된 熊膽 의 약침액을 점안약으로 사용하기 위하여 각막염을 일으 키는 균에 대하여 항균력을 알아보고자 세균성 각막염을 일으키는 균 중 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa와 진균 성 각막염을 일으키는 Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans 균주를 선택하여 각각 항균실험을 하였다. 대조군으로는 현재 강한 항균력으로 양방 임상에서 다용되고 있는 Cravit 점안약32,33)을 설정하 여 그 효능을 비교하였다.

항균력실험에서 세균인 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa 3종에 대해서는 Cravit는 항균효과를 보인 반면, 웅 담약침액은 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans 6종 에 대하여 50℃ 농도에서 전혀 항균효과를 나타내지 않아 약침에 사용되는 우황, 웅담과 저담의 항미생물 활성에 관 한 연구34)에서 웅담약침액이 항균효과를 보였던 것과는 다 른 결과를 보여주는 것으로 이는 약침액 제조상의 차이로 인한 것이 아닌 가 사료된다.

이상의 결과로 보아 알코올 수침법을 이용하여 제조된 웅담약침액은 감염성 각막염 유발균 6종에 대하여 실험적 으로 항균효과를 보이지 않았다. 다만 3㎎/㎖ 이상의 농도 로 실험이 진행되지 못한 것은 아쉬운 점이라 생각된다. 향후 3㎎/㎖ 이상의 농도로 제조된 약침액의 실험이 추가 적으로 필요하다고 생각되며, 이와 함께 염증의 기전과 관련된 연구도 진행되는 것이 바람직하리라 사료된다.

감염성 각막염을 치료하기 위한 점안제로 웅담약침액을 활용하기 위하여 각막염 유발균 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans에 미치는 항균효과를 알아보기 위하여 억제환 및 최소 성장 억제 농도 측정 시험을 통하 여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 3㎎/㎖ 농도의 웅담약침액은 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans에 대하여 50℃ 농도에서 향균 효과가 나타나지 않았다.

이상의 결과로 보아 알코올 수침법을 이용하여 제조된 웅담약침액은 각막염 유발 세균 및 진균 6종에 대한 항균 효과는 없었다. 향후 감염성 각막염 치료에 대한 한방 점 안약의 다각적인 연구 및 개발이 필요할 것으로 사료된다.