양식 어종에 적합한 배합사료를 개발하기 위해서는 우선적으로 대상어종의 필수영양소에 대한 요구량이 조사되어야 하며, 각각의 대상어종에 적합한 배합사료의 단백질/에너지 비율(P/E ratio)에 대한 연구가 이루어져야 한다. 단백질과 지방은 생체구성과 에너지 대사에 필수적 요소이며, 동물의 성장과 사료가격을 결정짓는 중요한 역할을 한다(Lee and Kim, 2005). 단백질 이용효율은 지방, 탄수화물과 같은 비단백질성 물질의 이용성 및 사료 내 단백질 수준과 밀접한 관련이 있다(Wang et al., 2014). 최근 여러 어종의 배합사료 내에 지방함량을 증가시키고 있는 추세이며, 충분한 지방함량은 사료 내 단백질을 절약하는 단백질절약효과(protein sparing effect)가 있다는 것이 증명되고 있다(Ng et al., 2008). 지방함량의 증가는 단백질절약효과(Cho and Kaushik, 1985; Ogata and Shearer, 2000; Sargent et al., 2002) 뿐 아니라 총 질소배출을 감소시키고(Yigit et al., 2002), 사료효율 및 성장을 증가시키는 것으로 보고되고 있다(Hillestad and Johnsen, 1994; Einen and Roem, 1997). 하지만 사료 내 과다한 지방함량은 어체와 복강 내 지방을 증가시켜 어체의 품질을 감소시키고(Einen and Skrede, 1998; Helland and Grisdale-Helland, 1998; Company et al., 1999), 사료 섭취율과 성장을 저하시킬 수 있다(Shearer et al., 1997; Silverstein et al., 1999). 고지방 사료의 효과는 환경적인 요인과 어종, 어류의 크기, 사료 내 단백질 함량, 사료공급률 등 여러 요인들에 의해 다르게 나타난다(Kim et al., 2006). Maris and Kissil (1979)은 gilthead seabream을 대상으로 한 연구에서 사료 내 단백질 함량이 44%일 때 지방 9%가 최대성장에 필요한 함량이라고 보고하였다. 이 함량은 참돔 사료 내 최적의 지방함량이 8-10%라고 보고한 값과 유사하다(Yone et al., 1971). 하지만 Takeuchi et al. (1991)은 참돔 치어의 배합사료 내 최적의 단백질 및 지방함량은 각각 52%와 15%로 보고하였다. 또한 Vergara et al. (1996)은 gilthead seabream 사료 내 지방함량이 15%일 때가 9%보다 유의적으로 높은 성장률을 보인다고 서술하였다. 이와 같이 어종 및 성장단계에 따라 차이를 보이고 있어 단백질과 지방 수준에 따른 P/E ratio 설정은 효율적인 배합사료 설계에 있어 매우 중요하다. 따라서 이 연구는 치어기 참돔의 효율적인 성장을 위한 사료 내 적정 P/E ratio를 설정 및 단백질과 지방함량의 수준에 따른 성장과 비특이적 면역반응을 알아보기 위해 수행되었다.

실용 사료원료를 기초로 총 9개의 실험사료를 제작하였다 (Table 1). 실험사료 디자인은 3×3 factorial design으로 3 단계의 조단백질(CP; 42%, 46% and 50%)과 3 단계의 조지방 함량(CL; 10%, 14%, and 18%)을 조합하여 제작되었다 (P42L10, 42%CP+10%CL; P42L14, 42%CP+14%CL; P42L18, 42%CP+18%CL; P46L10, 46%CP+10%CL; P46L14, 46%CP+14%CL; P46L18, 46%CP+18%CL; P50L10, 50%CP+10%CL; P50L14, 50%CP+14%CL; P50L18, 50%CP+18%CL). 실험구간에 적정 P/E ratio 규명을 위해 동일어종의 각 사료원료의 소화율을 참고하여 실험사료의 단백질/에너지 비율을 설정하였다(NRC, 2011). 실험사료는 우선 사료원들을 혼합기에 넣어 완전히 섞은 다음, 어유를 첨가한 뒤 사료원 총 중량의 30%에 해당하는 증류수를 첨가하여 혼합 및 반죽하였다. 혼합반죽물은 소형초파기(SMC-12, Kuposlice, Busan, Korea)를 이용하여 알맞은 크기로 뽑아내었다. 실험사료는 동결건조기로 24시간 건조시켜 사료공급 전까지 −20℃에 보관하면서 사용하였다.

실험에 사용된 참돔치어는 경상남도 고성군에 위치한 종묘배양장에서 구입하여 제주대학교 소속 해양과환경연구소로 이송하였다. 실험어류는 2주 동안 시판 배합사료를 공급하면서 실험환경에 적응할 수 있도록 순치하였다. 예비사육 후 참돔치어(초기평균무게: 7.66±0.03 g)는 총 27개의 150 L 원형 플라스틱 수조에 각 수조 당 30마리씩 무작위로 선택하여 배치하였다. 사육수는 모래여과해수를 사용하여 2-3 L/min의 유수량이 공급되도록 조절하였고 모든 실험수조에 용존산소 유지를 위하여 에어스톤을 설치하였다. 사육수온은 자연수온(21-27℃)에 의존하였으며 광주기는 형광등을 이용하여 12L:12D 로 유지되었다. 실험사료 공급은 1일 5-6회(08:00 h - 18:00 h)에 걸쳐 만복공급 하였으며, 실험은 총 10주간 진행되었다.

실험어의 무게는 3주마다 측정하였으며, 측정 24시간 전에 실험어류의 스트레스를 줄이기 위해 모든 실험어류를 절식시켰다. 사료공급 실험 후, 어류의 최종 평균무게를 측정하여 증체율(weight gain), 사료전환효율(feed conversion ratio), 일간성장률(specific growth rate), 단백질이용효율(protein efficiency ratio), 사료섭취율(feed intake) 및 생존율(survival)을 계산하였다. 최종 무게측정 후 수조당 6마리의 어류를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol (200 ppm)용액으로 마취시킨 후 주사기를 이용하여 미부동맥에서 채혈 하였다. 채혈된 혈액은 상온에서 60분간 방치시킨 후 원심분리기로(5,000 g) 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 비특이적 면역분석에 사용되었다.

실험사료의 일반성분 분석은 AOAC (1995) 방법에 따라 수분은 상압가열건조법(125℃, 3 h), 회분은 직접회화법(550℃, 6 h), 조단백질은 자동조단백질분석기(Kejltec system 2300,Sweden)로 분석하였으며, 조지방은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 Soxhlet 추출장치(Soxhlet heater system C-SH6, Korea)를 이용하여 분석하였다.

혈청 내 myeloperoxidase (MPO) 활성은 Kumari and Sahoo (2005)의 방법을 기초로 분석하였다. 먼저 HBSS (Hanks balanced salt solution)를 96-well plates에 80 μL씩 분주한 후 혈청 20 μL을 넣는다. 20 mM TMB (3,3'5,5'-tetramethyllbenzidine hydrochloride) 용액과 5 mM H₂O₂ 용액을 넣는다. 2분간 반응시킨 후 4 M H₂SO₄용액을 35 μL 첨가한 후 microplate reader (Thermo, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

혈청 내 lysozyme 분석은 Sankaran and Gurnani (1972)의 분석방법으로 분석하였다. Sodium citrate buffer (0.02 M, pH 5.52)에 동결 건조된 Micrococcus lysodeikticus (Sigma, USA)를 첨가하여 0.2 mg/mL 농도의 현탁액을 제조하였다. 현탁액과 혈청을 10:1의 비율로 혼합 시킨 후, 최초 450 nm에서 흡광도 값을 측정하고 24℃에서 한 시간 반응시킨 후 최종 흡광도 값을 측정하였다. Lyophilized hen egg white lysozyme (sigma, USA)를 이용하여 standard curve를 구하고 μg/mL로 표시하였다

혈청 내 Superoxide dismutase (SOD) 활성은 superoxide dismutase assay kit (Sigma, USA)를 이용하여 분석되었다.

실험사료의 배치는 완전확률계획법(Completely randomized design)을 실시하였으며, 분석결과는 SPSS (Version 12.0) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계 분석되었으며 데이터 값의 유의차는 Duncan's multiple test (P<0.05)로 비교되었다. 실험사료의 단백질과 지방 수준에 따른 상호관계는 Two-way ANOVA로 분석하였다. 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 계산하여 통계 분석되었다.

10주간 실시된 사료공급실험의 성장결과는 Table 2에 나타내었다. 사육기간 동안의 증체율, 단백질이용효율, 일간성장률, 사료섭취율 및 생존율은 사료 내 단백질 및 지방 함량에 영향을 받지 않았다. 증체율 및 일간성장률은 P46L14, P50L10 및 P50L14 실험구가 P42L18 실험구보다 유의적으로 높은 값을 나타내었지만, P42L10, P42L14, P46L10, P46L18 및 P50L18 실험구와는 유의차가 없었다. 같은 단백질 함량에서는 지방 14% 함유된 실험구의 증체율이 다른 실험구에 비해 다소 높은 경향을 나타내었으며, 18%의 고지방 첨가 실험구는 감소되는 경향을 보였다. 사료계수는 사료 내 지방함량(P<0.039)에 영향을 받았으며, 같은 단백질 함량에서 지방 함량이 증가함에 따라 사료계수도 증가하는 경향을 보였다. 사료계수는 P46L18 실험구가 P42L10, P42L14, P42L18, P46L10, P46L14, P50L10 및 P50L14 보다 유의하게 높았지만, P50L18실험구와는 유의한 차이가 없었다. 단백질이용효율은 P42L18실험구가 가장 높은 값을 나타내었지만, P42L10, P42L14, P46L10, P46L14, P50L10 및 P50L10 실험구와는 유의차가 없었다. 생존율은 고지방실험구인 P46L18실험구가 가장 낮은 값을 나타내었지만, P50L18 실험구와 유의차는 없었다. 이렇게 고지방 실험구에서 낮은 생존율을 보인 것은 산화적 스트레스에 의한 것으로 판단된다. 사료 내 높은 수준의 지방첨가는 산화적 스트레스를 일으켜 면역력 및 생존율을 저하시킬 수 있다고 보고되고 있다(Wang et al., 2014). 본 연구에서 참돔치어의 성장은 사료내 단백질함량에 관계없이 모든 실험구에서 14% 지방수준까지 증가하다 18%에서 감소되었다. 이로 미루어볼 때 치어기 참돔(7.7 g)의 지방 요구량은 14% 내외가 적절할 것으로 사료된다. 이는 참돔(초기무게: 30-40 g) 사료 내 최적의 지방함량이 8-10%라고 보고된 결과와 다르다(Yone et al., 1971). 지방요구량은 수온, 지방의 형태, 사료 내 단백질 및 에너지 수준에 따라 다르게 나타날 수 있으며(Wang et al., 2013) 적정 요구량에 비해 높은 수준의 지방 첨가는 단백질과 아미노산 같은 필수 영양소의 결핍으로 인한 성장률 감소를 야기시킬 수 있는 것으로 보고되고 있다(Daniels and Robinson, 1986; Mohanta et al., 2009). 지방이 10% 첨가된 실험구의 증체율은 단백질이 50%까지 증가할수록 높아지는 경향을 보였으나 지방이 14%, 18% 첨가된 실험구의 증체율은 단백질 46%까지 높아지다 50% 수준에서는 더 이상 증가하지 않고 정체되는 경향을 보였다. 지방함량 증가에 따른 단백질절약효과는 자바틸라피아(red tilapia, De Silva et al., 1991), 귀족돔(gilthead sea bream, Vergara et al., 1996), 조피볼락(rockfish, Lee et al., 2002)과 같은 육식성 어류에서 보고된바 있다. 단백질 절약효과는 사료 내 단백질, 지방, 탄수화물 함량 차이에 따른 상호작용에 의해 다르게 나타날 수 있다(Lim et al., 2013). 이러한 결과로 미루어 보아 본 연구에서는 치어기 참돔 사료 내 단백질이 46%일 때 14-18% 수준의 지방 첨가가 단백질절약효과를 가져올 수 있는 것으로 사료된다. 성장결과를 종합해 보면, 참돔 치어의 사료 내 단백질 함량 46%, 에너지가 16.8 MJ/kg이 최적의 성장을 나타낼 것으로 예상된다. 본 연구에서 참돔의 최대 성장에 해당하는 사료의 단백질에 대한 에너지 비인 27.4 g/MJ의 값은 대부분 어류의 적정 성장에 필요한 사료의 단백질에 대한 에너지 비(19-27 g/MJ) 범위 내에 있다(NRC, 1993).

사료 내 단백질과 지방함량에 따른 비특이적 면역반응을 알아보기 위한 분석결과는 Table 3에 나타내었다. 비특이적 면역반응(MPO 활성, Lysozyme 활성, SOD 활성)들은 사료 내 단백질과 지방함량에 영향을 받지 않았다. MPO활성은 P50L10실험구가 가장 높은 값을 나타내었지만, P42L14, P42L18, P46L10, P46L14, P46L18 및 P50L10 실험구와 유의차는 없었다. 이것은 적절한 영양소 및 에너지 함량이 아닌 사료의 설계는 어류의 면역력을 떨어뜨릴 수 있음을 시사한다. 다시 말해 영양소요구량에 맞게 사료의 조성이 설계되지 않거나, 오히려 과영양으로 설계된다면 어류의 면역력에 부정적인 영향을 끼칠 수 있음을 의미한다. SOD활성 분석결과는 P46L14와 P46L18 실험구가 P46L10, P50L10 및 P50L18 실험구와 비교하여 유의적으로 높은 값을 나타내었다. 성장률의 결과에서 알 수 있듯이 적절한 영양소 및 에너지가 포함되도록 설계된 실험구에서 비특이적 면연력이 증가하는 것을 알 수 있었다. Lysozyme 활성 분석결과는 모든 실험구에서 유의적인 차이를 관찰할 수 없었다. Rawles et al. (2011)은 sunshine bass (Morone × M. saxatilis) 사료 내 단백질 함량이 47.3-34.7%까지 감소함에 따라 비특이적 면역반응이 감소하는 추세를 보이며, 단백질과 지방 함량은 어류의 비특이적 면역력에 영향을 줄 수 있다고 서술하였다. 또한 Wang et al. (2014)은 사료 내 높은 수준의 지방첨가는 산화적 스트레스에 의한 면역력 저하를 야기할 수 있으며, 자가사리(yellow catfish)의 정상적인 생리활성을 위한 적정 지방 수준은 6-8% 범위라고 서술하고 있다. 본 연구의 경우 단백질과 지방 수준에 따른 면역력 변화에 대한 명확한 차이는 보이지 않으나 전체적인 경향을 살펴볼 때 단백질 함량이 동일한 실험구내에서 지방이 14% 함유된 실험구들과 단백질이 46% 함유된 실험구들의 면역활성이 다소 높은 경향을 보였다.

결론적으로 이상의 모든 결과를 종합해 볼 때, 치어기 참돔(7.7 g)의 성장과 면역력 향상을 위해서 사료 내 최적의 단백질에 대한 에너지 비는 27.4 g/MJ, 에너지는 16.8 MJ/kg이 적절할 것으로 조사되었으며, 적정 단백질과 지방함량은 각각 46%와 14% 일 때 가장 효율적일 것으로 사료된다.