식물 추출물을 활용한 작물 병해충 방제기술 수요가 최근 급격히 증가하고 있으며, 이를 위한 식물 추출물별 병해충방제 기능성에 대한 연구도 여러 분야에서 진행되고 있다(Kwon
고삼 추출물의 병해충 방제 기능 성분으로는 matrine, oxymatrine 같은 alkaloid 계열성분(Liu
정제에 사용한 Solid Phase Extract (SPE) 카트리지는 ENVI-CarbTM (500 mg, Sigma-Aldrich, PA, USA)과 C18 카트리지(500 mg, GL Science, Japan)를 사용하였다. 분석대상으로 사용한 표준물질인 matrine과 oxymatrine은 ChromaDex사(Irvine, CA, USA)의 제품을 사용하였다. Methanol, acetonitrile은 TEDIA사(Fairfield, OH, USA)의 HPLC등급 시약을 사용하였으며, triethylamine과 formic acid는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)의 reagent급 제품을 사용하였다. 표준품의 stock solution은 1,000 mg/L 농도로 methanol에 녹여 조제하고 −20℃ 냉동고에 보관하면서 필요할 때 적정 농도로 희석하여 검량선 작성에 사용하였다. Reagent급 염화나트륨 및 무수황산나트륨은 Merck (Darmstadt, Germany) 제품을 사용하였다.
안정성 평가 시험에는 중국산 고삼 추출물과 Biopesticide A (㈜바이오아그로, 한국), Biopesticide B (㈜참농지기, 한국) 등 2종의 유기농자재를 국내에서 구입하여 사용하였다. 추출물과 제품의 총 matrines 함량(matrine과 oxymatrine의 총량)은 각각 16,924 mg/L, 7,783 mg/L와 5,726 mg/L이었으며, matrine 함량이 80% 이상을 차지하였고, oxymatrine 함량은 높지 않은 것으로 확인되었다.
탈산소 조건의 안정성 평가는 증류수 19 mL를 갈색유리병에 넣고, 질소가스를 1시간 동안 폭기하여 산소를 제거한 후 질소기류 하에서 시료 1 mL를 넣은 뒤 밀폐하고, 실온에서 시험기간 동안 150 rpm으로 연속 교반하였다. 호기조건의 안정성 평가 시험은 증류수 19 mL와 시료 1 mL를 섞은 갈색유리병에 폭기장치를 설치하고 200 mL/min의 유속으로 공기를 주입하면서 진행하였다. 이 후 12주간 7일 간격으로 시료를 채취하여 유효성분 2종을 분석하여 분해율을 조사하였다.
고삼 추출물 및 이를 주성분으로 하는 유기농자재 2종을 이용하여 유효성분의 토양 중 안정성을 평가하였다. 토양 시료는 사양토를 그늘에서 건조시킨 후 2 mm 체로 쳐서 시험 전까지 냉암소에 보관하였다. 1 mL의 고삼 추출물과 유기농자재 시료를 각각 0.1 M triethylamine methanol 용액 10 mL에 희석하고, 미리 준비한 건조 토양 20 g에 분무한 뒤, 1시간 동안 교반기로 섞어 주었다. 토양을 10 mm 이하의 두께로 넓게 펼친 후 실온 암조건에서 안정성 평가를 실시하였다. 또한, 함수토양에 대한 안전성 평가 시험은 멸균되지 않은 건조 토양 20 g에 위와 동일한 방법으로 분무처리하고, 토양 수분이 포장용수량의 60%가 되도록 증류수를 골고루 섞어주며 넣고, 덮개를 덮은 뒤 72 시간 동안 격렬하게 진탕하였다. 이후 실온 암조건에서 마개를 막아 수분증발을 억제하는 조건에서 1주일 간격으로 시료를 채취한 뒤 유효성분 2종의 함량을 분석하였다.
토양 중 총 세균수는 Kim 등(2014)의 방법으로 측정하였다. 토양 1 g을 멸균 증류수에 녹인 0.1% peptone 용액 9.0 mL에 넣고 vortexing하여, 추출용액을 제조하였다. 추출용액은 10배씩 순차희석하고, 희석용액은 일반세균용 petrifilm (3 MTM, Minnesota, USA)에 1 mL씩 접종하였다. 접종이 완료된 petrifilm을 30℃에서 2일간 배양한 후 총 세균수를 측정하였다.
고삼 추출물의 주요 유효성분인 matrine 및 oxymatrine 2종의 분석은 Lim 등(2014)의 분석법에 따라 다음과 같이 실시하였다. 수중 안정성 평가를 위한 수용액시료는 다음과 같이 전처리 하였다. 시료 1 mL를 ENVI-CarbTM 카트리지에 주입하고, 10분간 안정화 시킨다. 이 후 증류수 12 mL로 세척하고, ENVI-CarbTM 카트리지 하단에 C18 카트리지를 연결한 뒤, 12 mL methanol로 용출시킨다. 마지막으로 ENVICarbTM 카트리지를 제거 후 C18 카트리지를 methanol 6 mL로 용출 시킨 뒤 용출용액을 모두 모아 감압농축 후 methanol 1 mL에 재 용해하여, Lim 등(2014)이 설정한 조건에서 ultra performance liquid chromatography (UPLC)를 통한 정량분석을 실시하였다. 토양 중 안정성 평가를 위한 시료는 토양 20 g을 0.1 M triethylamine이 포함된 acetonitrile 20 mL로 2시간 진탕 추출하고, 여과 후 감압 농축하였다. 농축된 시료는 5 % methanol 1 mL 수용액에 재용해한 후 ENVICarbTM 카트리지에 주입하였다. 이 후 카트리지 정제는 수용액 시료의 정제와 동일한 과정을 거친 후 기기분석을 실시하였다.
고삼 추출물 및 이를 주성분으로 하는 유기농자재 2종에 대해 수중 안정성을 탈산소 조건과 호기 조건에서 각각 시험하였다. 추출물과 유기농자재 2종 모두 수용액 상태에서 12주간 총 matrine분해율이 20% 미만으로 확인되었고, 총 matrines 수중 반감기는 추출물과 농자재에서 모두 30주 이상인 것으로 예측되었다(Fig. 1). 또한, 총 matrines의 80% 이상을 차지하는 matrine의 수중 분해율은 추출물 및 제품에서 모두 10% 미만으로 확인되었으나, oxymatrine 분해율은 최대 80%까지 확인되었고, 이를 통해 oxymatrine의 분해가 총 matrines 감소의 주요 원인인 것으로 판단되었다. Oxymatrine의 반감기는 2종의 제품에서 각각 28일과 200일 이상으로 확인되었고, 이러한 반감기 차이는 유기농자재 내 포함된 보조제 등의 영향인 것으로 판단된다. 그리고 산소에 의한 matrines분해 감소 영향을 살펴보기 위해 진행된 호기 조건과 탈산소 조건의 비교시험에서 유의적인 차이가 발견되지 않았으며, 이러한 결과로 볼 때 matrine과 oxymatrine은 산소에 의한 접촉산화에는 비교적 안정적인 것으로 판단된다.
토양 노출에 의한 matrine 및 oxymatrine 안정성 평가는 건조토양과 60% 함수토양에서 각각 진행되었으며, 건조토양에서 진행된 시험결과, 14일 경과 후 50% 수준으로 분해되었고, 84일 경과 후 60-73.5%의 총 matrines 분해율이 관찰되었다. 건조 토양에서 matrine 분해패턴은 수중 분해패턴과 달리, 시험시작 14일 이전에 급격히 분해가 진행되고, 이후 분해율이 급격히 감소하는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 따라서 본 연구에서는 single exponential decay equation(offset)를 사용하여 총 matrine의 초기 분해 속도를 구하였다. 시험 결과, 건조 토양에서 고삼 추출물의 초기 분해 속도상수 k는 0.0804 (t1/2=8.6일)로 나타났으며, Biopesticide A와 B의 초기 분해 속도상수 k는 각각 0.1275 (t1/2=5.4일)와 0.1144 (t1/2=6.0일)로 계산되어, 추출물과 유기농자재 제품간 반감기 차이가 크게 나타나지 않았다. 건조 토양에서 총 matrines 반감기가 수중 시험에서 보다 짧은 것은 토양광물에 의한 분해 촉매작용이 주요한 요인으로 고려되었다. 또한, 노출 후반기의 분해율이 급격히 감소하는 것은 고삼 추출물 등 처리된 유기물이 토양 표면에 견고한 피막을 형성하기 때문인 것으로 판단된다(Fig. 3). 그리고, 건조 조건에서는 토양 생물활동이 제한적이므로, 미생물 등 생물학적 요인에 의한 matrines 분해 영향은 낮은 것으로 기대되었다.
60% 함수토양에서 진행된 총 matrines의 토양 노출 안정성 평가 결과, 시험기간 전체에 걸쳐 분해율이 일정하게 나타남에 따라, 1st order equation을 이용하여 분해 반감기를 산출하였다. 고삼 추출물의 총 matrines반감기는 33.0일로 확인되었고, 유기농자재 2종의 경우, Biopesticide A는 231일, Biopesticide B는 69.3일로 예측되어, 유기농자재에 포함된 보조제의 영향이 크게 작용함을 알 수 있었다(Fig. 4). 함수 토양 내 일반세균 분포의 변화 관찰 시험에서, 총 일반세균수가 6.0 log colony forming unit (CFU)/g-soil 이상을 유지하고 있는 것이 확인되어 고삼 추출물의 일반세균에 대한 항균성이 높지 않은 것으로 사료되었다. 또한, 함수 토양 내 일반세균수는 보관 2-3주 경과 후 증가하기 시작하여 8.0 log CFU/g-soil 수준에서 일정하게 유지되었으며, 이러한 결과는 고삼 추출물 및 유기농자재 2종이 각각 처리된 함수토양에서 모두 유사하게 나타났다(Fig. 5). 따라서 함수 토양에서는 화학적 분해요인과 함께 생물학적 분해요인이 alkaloid계 유효물질의 안정성에 영향을 미치는 것으로 판단되었고, Sun 등(2010)이 보고한 matrines 반감기(6.70–9.18일) 결과에서 볼 수 있듯이, 실제 농업 환경에서의 고삼 중 matrine 반감기는 본 연구에서 고려되지 못한 토양 생물, 태앙광 등의 다양한 환경요인으로 인해 본 시험에서 도출된 유효성분 반감기 보다 짧을 것으로 기대된다.
그리고, matrine과 oxymatrine의 성분별 토양 노출 안정성 시험결과는 수중 노출 시험 결과와 같이 oxymatrine의 분해율이 matrine 분해율 보다 높게 관찰되었다.
고삼 추출물의 작물 병해충 방제 기능성 물질로 알려진 matrine과 oxymatrine의 수중 및 토양 노출 안정성을 추출물 원액과 이를 활용한 유기농자재에서 각각 평가한 결과, 고삼 추출물과 유기농자재를 물에 희석한 채 보관할 경우 유효성분 안정성이 높아 상당한 기간 동안 보관할 수 있을 것으로 판단되었다. 반면, 토양 노출의 경우 건조 토양의 반감기가 함수 토양의 반감기보다 짧은 것으로 예측되었다. 그리고, 실제 농업 환경에서는 토양 광물에 의한 분해 촉진, 토양 생물활동, 광 노출 등 다양한 요인을 고려할 경우, matrine의 환경 노출 안정성은 본 연구 결과보다 더 낮아 질 것으로 판단된다.
