염증반응은 생체 조직이 손상을 입거나 외부 화학물질의 침입이나 세균반응에 대항하여 손상부위를 회복 재생하려고 일어나는 체내 방어적 반응으로 발열이나 통증을 일으킨다(Imm and Kim, 2010). 또한, 염증반응은 대식세포, 호중구 등과 같은 면역관련 세포들이 염증성 cytokine, nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2 (PGE2) 등의 염증매개물질을 분비하여 발생한다(Adams and Hamilton, 1984). 특히, NO는 세포 내 L-arginine의 산화반응을 촉진하는 NO 합성효소(inducible nitric oxide synthases, iNOS)에 의해 생성되는데, 세균성 염증 유발 성분인 lipopolysaccharide (LPS)가 대식세포를 자극하면, 활성화된 대식세포가 iNOS를 발현하여 NO의 생성을 유도함으로써, 염증반응을 유발하게 된다(An et al., 2014; Chung et al., 2011). 또한, NO는 생체 내에서 염증에 반응하는 생체 내 분자로써 반응성이 높고, 면역 반응에서 화학적 매개체의 역할을 하며, 혈관의 이완 및 신경전달에 관여한다(An et al., 2014; Chung et al., 2011). 따라서, LPS가 자극한 대식세포에서 유도되는 NO의 생성을 억제할 수 있는 새로운 인자를 연구하고 개발하는 것은 염증성 질환의 치료 및 면역 반응에서 중요한 역할을 할 것으로 여겨진다.
암은 2004년 통계청에 의하면 우리나라 전체 사망원인의 26.3%를 차지하는 주된 사망원인이었으며, 지금까지도 매년 600만명 이상이 암으로 고통 받고 있는 실정이다(Kim et al 2006). 인체는 면역반응이 정상적으로 유지되지 않을 경우, 세포가 일정하게 증식과 사멸을 유지하는 항상성을 상실하면서 이상증식이 일어나 암으로 발전하고, 이에 따라 암은 면역기능 이상으로 유전적 변이 세포를 사멸하는 면역질환으로 볼 수 있다(Ha et al., 2010; Jin et al., 2009). 따라서, 만성 염증과 암 또는 다른 질병과의 상관 관계에 있어서, 염증 반응을 감소시킴으로써 질병의 위험을 줄이려는 노력이 진행되고 있다(Imm and Kim 2010; Aggarwal et al., 2006). 이러한 점들을 감안할 때, LPS가 자극한 대식세포에서 유도되는 NO의 생성을 억제하고 암세포의 증식을 억제할 수 있는 새로운 천연 소재를 연구하고 개발하는 것은 매우 유용하다고 할 수 있다.
미생물들은 최근 대체에너지와 식량, 고부가가치의 의료용 물질 등 산업적으로 유용한 물질을 생산한다(Fu et al., 2014). 또한, 미세조류는 광합성을 통해 지구 생태계에서 1차 생산자 역할을 함으로써 해양생물양식에서 잠재적인 식품 소재로서 이용될 수 있다(Teo et al., 2014; Wei et al., 2013). 게다가, 미세조류의 지방산이나 sterol과 같은 지질 성분에 대한 연구가 수행되어 왔으나, 바이오 원료가 대부분이었고, 최근에야 미세조류의 생리활성에 대한 연구가 진행되고 있다(Teo et al., 2014; Wei et al., 2013; Cha et al., 2010). 이 중,
이번 연구에서는 해양미세조류인
실험에 사용된 광합성 미세조류
Total sterol의 정량은 Liebermann-Burchard Nath et al. (1946)의 방법에 따라 측정하였다. Liebermann-Burchard 시약의 제조는 Acetic anhydride 220 mL과 glacial acetic acid 200 mL을 혼합하고 sulfuric acid 30 mL을 추가 혼합하였고 standard는 200 mg 콜레스테롤을 glacial acetic acid 100 mL에 녹여 갈색병에 보관하였다. NOH 분획물(NOH1, NOH2, NOH3 및 NOH4) 시료는 2 mg을 glacial acetic acid 1 mL에 녹여 갈색병에 보관하였다. 96 well plates를 사용해 각각 정량하여 10분 동안 반응시킨 후 625 nm에서 흡광도를 측정하여 sterols의 함량을 정량하였다.
생쥐 대식세포계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 penicillin-streptomycin 100 units/mL과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대 배양을 시행하였다(Wei et al., 2013; Cha et al., 2010). 인간 혈액암 세포인 HL-60 (human promyelocytic leukemia cells) 세포주를 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양 받아 100 units/mL의 penicillin-streptomycin (GIBCO)과 10%의 fetal bovine serum(FBS; GIBCO)이 함유된 RPMI 1640 (GIBCO)을 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3~4 일에 한 번씩 시행하였다.
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항염 활성을 위한 Nitric oxide (NO) 생성 평가
4개의 NOH 분획물(NOH1, NOH2, NOH3 및 NOH4)이 LPS가 자극한 대식 세포의 NO 생성에 영향을 줄 수 있는 지를 확인하였다. RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5×105 cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 추출물 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약[1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액에서 측정하였다. 세포배양 상층액 100 μL와 Griess 시약 100 μL를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Adams and Hamilton, 1984; An et al., 2014; Chung et al., 2011).
4개의 NOH 분획물(NOH1, NOH2, NOH3 및 NOH4)이 혈액암 세포의 성장에 대한 억제 효과를 가지는 지를 측정하기 위해, MTT assay를 수행하였다. HL60 세포(1×105 cell/mL)를 96 well plates에 분주하여 24시간 배양한 후, 시료를 농도별 (12.5, 25, 50, 100 및 200 μg/mL)로 첨가하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 24시간동안 배양한 후, 2 mg/mL의 농도로 제조한 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액 50 μL를 첨가하고 동일한 조건에서 3시간 배양하였다. Plate를 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, 각 well에 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma) 150 μL를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후, microplate reader (Bio-TEK instrumenis. Inc., Winooski Vermont, WI, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 증식억제 정도를 조사하였다(Ha et al., 2010).
모든 분석 수치는 mean ± SD 으로 나타내었다. 수집된 결과는 SPSS (SPSS Inc., Version 12.0) 프로그램을 이용하여 통계분석하였으며, 각 실험군들의 평균치간의 유의성은
Terpene 계열의 sterols은 여러 가지 색소체들의 면역기능강화 효과로 인해 하루에 2,000 mg 내지 3,000 mg의 sterols을 섭취할 경우 면역 기능이 향상되는 것으로 알려져 있다. Sterols은 채소와 과일 견과류 등에 섬유소와 함께 붙어있는데 음식물을 가공 할 시에 여러 화학물질과 고열로 인하여 sterols의 양이 경감된다. 그러므로 sterols을 충분히 흡수하기 위해서는 천연 그대로 섭취하는 것이 좋다. 그래서 미세조류를 통한 sterols의 섭취가 각광받고 있는 이유 중 한가지다. 특히, 지질 성분이 세포의 지질 속에 유리 또는 에스터 등의 유도체로 존재하며 다량 함유되어 있다고 보고되었다. 따라서 지질추출을 위하여 비극성 용매인
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항염 활성을 위한 Nitric oxide (NO) 억제효과
대식세포는 염증매개물질(cytokines, prostaglandins 및 NO)을 방출하는 것을 통해 선천면역과 후천면역에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 염증성 질병에서 중심적인 역할을 한다(Kim et al., 2013). 특히, NO는 NO 합성효소(inducible isoforms of NO synthase, iNOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 유리체로 여러 가지 생물학적 과정에 관여하며, 세포독성, 신경 전달계, 면역반응 및 혈관이완 등에 관여한다. NOH 분획물(NOH1, NOH2, NOH3 및 NOH4)을 마우스 대식세포인 Raw264.7 세포에 처리하여 NO 생성 억제효과를 연구한 결과, 각각 다른 NO 생성 억제효과를 나타냈다(Fig. 2). Sterols를 open silica column를 통해 분리한 NOH1은 25 µg/mL부터 활성을 나타내며, 100 µg/mL는 높은 활성을 보여 농도 의존적으로 NO생성억제 효과를 보여주는 것을 확인할 수 있다. 세포생존율에서도 NOH1은 세포독성이 없는 것을 확인 하였다. NOH3과 NOH4는 NOH1보다 보다 뛰어난 NO 억제활성을 보이나 세포독성이 높은 것을 확인 하였다(Fig. 2). 위 결과를 통해 확인할 수 있는 부분은 sterols가 많이 함유되어 있을수록 높은 활성을 보인다 라고 할 순 없지만 sterols의 함량에 따라 sterols를 가장 많이 함유한 NOH1에서 높은 활성에 독성이 없는 활용 가능한 샘플이 만들어지는 결과가 나오는 것을 확인 하였다.
이전 연구들에서 sterols는 전립선 암 세포와 유방암 세포 및 폐암과 난소암 세포를 사멸시키며, 암세포를 공격하는 T-세포의 기능을 증강 시키는 것으로 알려져 있다. 또한 DNA단편화 실험에서는 DNA를 분해하고 세포 분열주기 실험에서는 G1 단계를 억제하는 것으로 알려져 있다(Park et al., 2006; Lee et al., 2006). 이처럼 sterols는 암세포 억제에 대한 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다. 이에 본 연구는 NOH를 인간혈액암 세포 HL60에 처리하여 암세포 성장억제 효과를 조사한 결과, NOH2를 제외한 모든 시료에서 농도 의존적으로 암세포 억제 효과가 뛰어난 것을 확인 하였다(Fig. 3). 이 결과는 여러 물질이 섞여 있는 것보다 단일 sterols를 분리했을 때 더 높은 활성을 나타내는 것을 증명한다. NOH3이나 NOH4의 경우 NOH1 보다 낮은 농도인 12.5 µg/mL부터 암세포 성장억제 효과가 좋은 것으로 볼 수 있으나, 세포생존율에서 NOH3과 NOH4의 경우 RAW 264.7에서 세포독성(Cytotoxicity)이 있는 것을 확인 하였다(Fig. 2). sterols를 가장 많이 함유하고 있는 NOH1에서 항염활성 결과와 마찬가지로 세포독성이 없고 활성이 뛰어난 물질이 존재하는 것을 확인 하였고, 이 결과는 sterol이 암세포 억제에도 효과가 있다는 것을 증명한다. 세포독성이 존재 할 경우 기능성 식품이나 의약품 개발로 사용 하기에는 적절하지 않기 때문에 NOH1이 여러 측면에서 가장 활용도가 높은 시료로 생각된다.
본 연구는