The disease resistant (
Effect of acute toxicity to
This result suggested that there was no significant difference in toxicity to
생명공학(Genetically Modified, GM) 작물은 2013년에 1억 7,530만 헥타르가 재배되어 처음 상업적으로 재배되기 시작한 1996년보다 무려 100배 이상 증가하였고, 전 세계 36개국에서 27작물 336이벤트의 GM작물이 재배 승인된 것으로 농업생명공학 응용을 위한 국제서비스(ISAAA)는 보고하고 있다(James, 2013). GM작물은 작물 생산에 필요한 노동력과 농기계, 농약 등의 사용 절감에 따른 경제적인 이익뿐만 아니라(Owen, 2000), 기후 변화 등의 농업환경 변화에 지속 가능한 작물의 생산을 가능케 한다(Brookes and Barfoot, 2006). 그러나, GM작물이 재배되기 시작한 1996년부터 재배 면적의 증가와 함께, GM작물 재배 지역의 환경 및 생태계 위해성과 식품 섭취에 따른 인체 영향 및 안전성에 대한 우려도 여전히 제기되고 있다.
2013년까지 우리나라에서 상업적으로 재배가 승인된 생명 공학작물은 없으나 농촌진흥청, 대학 및 기업에서 벼, 잔디, 고추, 감자, 배추, 토마토 등을 중심으로 다양한 기능의 유전자 도입이 시도되고 있으며, 기능이 검증된 일부 GM작물의 이벤트 계통들은 안전성평가를 통한 실용화를 진행하고 있다. GM작물들의 실용화 단계는 GM작물에 도입된 유전자의 발현에 의한 독성, 알레르기와 영양 성분 등에 관한 식품안전성 평가 및 유전자이동성, 생태계 교란 등에 대한 환경위해성 평가를 수행해야하며 그 중에서도, 특히 도입 유전자 산물의 표적 및 비표적 생물체에 대한 영향 평가가 GM작물의 안전성 심사의 필수 항목으로 요구되고 있다(Oh
Toriyama 등(1988)에 의해서 최초 형질전환체 벼(
벼는 담수조건에서 생육하므로 GM벼의 실용화를 위한 환경위해성 평가 항목에서 일반적인 평가 대상인 나비목, 노린재목, 딱정벌레목 등의 대표적인 육상 곤충 이외에 물벼룩, 잉어, 미꾸리 등의 수서환경 비표적 생물체에 대한 평가도 이루어져야 한다. 최근 환경위해성 평가 항목인 비표적 수서생물종에 미치는 영향을 분석하기 위하여 해충저항성 Bt벼와 비타민 A강화벼가 물벼룩(
본 시험에서는 병저항성 GM벼에 대한 환경 생물 독성시험을 위해서 환경생물 독성 시험 기준과 방법 (농촌진흥청 고시 제 2010-29호)에 명시된 환경생태독성 시험 생물로서 가장 널리 사용되는 생물검정 재료인 물벼룩을 대상으로 병저항성 GM벼에 대한 영향을 분석하였다. 병저항성 GM벼의 choline kinase (
병저항성 GM벼(event LS28 30-32-20-9-7)와 비형질전환 모품종인 낙동벼를 국립농업과학원 GMO 격리 포장(경기도 수원시 서둔동)에서 재배하고 잎과 줄기부위를 수확하여(출수기) 동결건조한 후(일신랩 FD8518, 한국), 분쇄기를 이용하여(한일전기, HMF-3100S, Korea) 분말화 하였다. 분쇄된 시료는 600 ㎛의 표준망체(청계산업, 한국)를 통과시킨 후, 사육용수에 현탁하여 급성독성 분석용 시료로 이용하였다. 시험물질인 부형제를 수질오염공정시험기준(ES 04751.1)의 물벼룩을 이용한 급성독성시험법(2010)에 따라 조제된 배양액에 현탁시켜 조제하였다.
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Genomic DNA 분리 및 PCR(Polymerase chain reaction) 검정
병저항성 GM벼와 낙동벼 시료를 각 1 g씩을 취하고, 막자사발에서 액체질소와 함께 분말화한 후 DNeasy plant kit(Qiagen, CA, USA)를 이용하여 genomic DNA를 분리 하였다. NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc, Wilmington, USA)을 이용하여 260/280 nm 값이 1.8∼2.0 사이인 추출액을 실험에 이용하였다. 식물형질전환용 운반체의 유전정보를 바탕으로
[Table 1.] Primers list used for PCR(Polymerase chain reaction) analysis
Primers list used for PCR(Polymerase chain reaction) analysis
병저항성 GM벼에 choline kinase(
PAT 단백질의 농도를 정량하기 위하여 각 시료들을 마쇄한 후 PBST용액과 함께 균질화 한 후 저온처리(얼음에서 5분) 및 원심분리(5,000 g, 5분)하여 단백질을 분리, 추출한 후 PAT/bar ELISA kits(EnviroLogix LibertyLink, Portland, USA)를 이용하여 ELISA분석을 실시하였다. 모든 시료들은 상온에서 2시간 반응한 후 ELISA reader(Multiskan EX, Thermo Scientific)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다(Kim
물벼룩(
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물벼룩 급성독성 시험의 병저항성 GM(OsCK1)벼와 낙동벼 처리 조건
병저항성 GM벼와 낙동벼의 시료에 대한 유효농도 설정 예비시험결과, 48시간 EC50값이 1,000.00∼10,497.60 ㎎/L 범위 내에 있을 것으로 추정되어 1,000, 1,800, 3,240, 5,830, 10,500 및 20,000 ㎎/L의 농도에서 시험을 수행하였다. 시험용액은 조제된 시료를 0.100, 0.180, 0.324, 0.583, 1.050 및 2.000 g씩 정확히 칭량하여 100 mL의 배양액에 반복구당 각각 처리하여 시험용액으로 사용하였으며, 대조구로 시험용수인 배양액을 음성대조구로 설정하였다. 시험에는 생후 24시간이내의 비슷한 크기의 어린 물벼룩을 사용하였으며, 시험개체수는 농도당 각 10마리씩, 3반복으로 처리하였다. 시험용액은 200 mL 용량의 곤충사육용기 (100 x 40 mm)에 100 mL를 처리하였으며, 노출환경은 사육조건과 동일한 수온 20±2℃를 유지하였다.
물벼룩에 대한 급성독성여부를 규명하기 위하여 각 처리구에 대하여 24시간 경과 후 일반중독증상, 특이증상 및 유영저해 개체수 등을 분석하였다. 유영저해의 판정을 위해 시험 용기를 조용히 움직이고 15초 후에 촉각 및 후복부 등은 움직이나 유영하지 못하는 것을 유영저해 물벼룩으로 간주하였다. 시험기간 중 시료 처리직후와 종료 시의 각 처리구에 대하여 pH 및 Dissolved oxygen(DO)를 조사하였으며, 수온은 24시간 간격으로 조사하였다. pH와 수온은 HANNA사의 pH meter를 사용하였고, DO는 ISTEK사의 DO-300L DO meter를 사용하여 측정하였다. EC50 산출 및 무영향농도(NOEC, No observed effect concentration)는 시험물질 처리 후 48시간의 유효성분에 대한 반수영향농도(EC50) 및 95% 신뢰한계를 probit분석법에 의해 산출하였다. 무영향농도는 중독증상이 없고 유영저해가 발생하지 않는 최고 시험농도로 표시하였다.
전세계적으로 농업적 및 경제적인 이유로 다양한 유전자 변형(GM) 작물이 재배되고 있다. 국내에서도 주요 식량 작물인 벼를 대상으로 다양한 유전자가 도입된 GM작물들이 개발되고 있으며, 근래에 벼 유래의 choline kinase 유전자(OsCK1)를 과발현시켜 벼도열병과 벼흰잎마름병에 저항성을 나타내는 병저항성 GM벼가 개발되었다(Lee
물벼룩 영향평가 시료로 사용된 병저항성 GM벼의
PAT protein levels (μg/g Dry weight) in non-Genetically modified (non-GM) rice (Nakdong) and Disease Resistant (OsCK1) rice
본 시험에 사용된 시험용수에 대한 시험기간 중 수질검사는 시험물질 처리 직전과 시험 종료시 수온, pH를 조사하였다. 시험기간 중 시험용수의 수온은 낙동벼 처리구에서는 평균 20.9±0.1℃ (20.4∼21.2℃)이었고, 병저항성 GM벼(OsCK1 rice)처리구에서는 평균 21.0±0.2℃ (20.5∼21.5℃)로 측정되었다(Table 3).각 시험농도에서 품종간 물벼룩의 사육 온도에 대한 t-test 검정결과 0, 1,000, 1,800, 3,240, 5,830, 10,500 및 20,000 mg/L 처리구에서 48시간 후에는 각각
Changes of water temperature (℃) during cumulative immobility tests of Daphnia magna in non-Genetically modified (non-GM) rice (Nakdong) and Disease Resistant (OsCK1) rice
pH는 0시간(시험용수에 시료 현탁시) 처리조건에서 낙동벼 처리구는 평균 7.13(6.49∼7.50), 병저항성 GM벼 처리구는 평균 7.06(6.46∼7.42)로 측정되었다. 시험 48시간에서는 낙동벼는 평균 6.64(5.95∼7.37), 병저항성 GM벼는 평균 6.63(6.03∼7.25)로 측정되었다. 반면에 음성대조구(0 mg/L)의 0시간 처리에서는 평균 7.73과 48시간 7.61로 측정되었다. 이는 유기물 시료인 낙동벼와 병저항성 GM벼가 물벼룩의 호흡 등 생리 작용과 미생물에 의한 유기물 분해 작용에 의해 pH의 차이에 영향을 주었을 것으로 사료된다(Table 4). 각 시험농도에서 병저항성 GM벼와 낙동벼간 물벼룩의 시험용수 pH에 대한 t-test 검정결과 0, 1,000, 1,800, 3,240, 5,830, 10,500 및 20,000 mg/L 처리구에서 48시간후에는 각각 p값이 0.94, 0.69, 0.12, 0.09, 0.56, 0.51, 0.45이었다. 따라서 모든 처리농도에서 두 품종간 시험용수 pH에는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다(
Changes of pH during cumulative immobility tests of Daphnia magna in non-Genetically modified (non-GM) rice (Nakdong) and Disease Resistant (OsCK1) rice
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병저항성 GM(OsCK1)벼와 낙동벼의 처리농도에 따른 물벼룩의 유영저해 변화
병저항성 GM벼와 낙동벼의 물벼룩 급성독성시험을 48시간 동안 지수식으로 농도당 노출 물벼룩 10마리에 대한 생사수를 관찰, 조사하였으며 총 3반복 실시하였다. 물벼룩은 유기 및 무기 독성물질에 민감하게 반응하므로, 독성 측정을 위해서는 일반적으로 24시간 및 48시간 후의 유영저해 측정이 이용된다(Kim
낙동벼 처리구에서 1,000∼20,000 ㎎/L의 시험농도에서 물벼룩 급성독성시험을 실시한 결과, 물질 처리 후, 24시간 경과시 1,000, 1,800, 3,240 ㎎/L 처리구에서는 유영저해개체가 없었으나, 5,830, 10,500 및 20,000 ㎎/L 처리구에서 24시간 경과시 각각의 농도에서 30, 66.6, 96.6%의 유영저해 개체가 관찰되었으며, 48시간 경과시 1,000 ㎎/L 처리구에서는 유영저해 개체가 없었으나 1,800, 3,240 및 5,830 ㎎/L 처리구에서는 33.3, 40, 56.6%의 유영저해 개체가 관찰되었다. 10,500과 20,000 ㎎/L 처리구에서는 48시간 후에 모두 100% 유영저해 개체로 관찰되었다. 병저항성 GM벼 처리구에서 1,000∼20,000 ㎎/L의 시험농도에서 물벼룩 급성독성 시험을 실시한 결과, 물질 처리 후 24시간 경과시 1,000, 1,800 ㎎/L 처리구에서는 유영저해개체가 없었으나, 3,240, 5,830, 10,500 및 20,000 ㎎/L 처리구에서 각각의 농도에서 33.3, 43.3, 60, 70%의 유영저해 개체가 관찰되었으며, 48시간 경과시 1,000 ㎎/L 처리구에서는 낙동벼와 동일하게 유영저해 개체가 없었으나, 48시간 후에 1,800, 3,240, 5,830 ㎎/L 처리구에서 43.3, 53.3, 56.6%의 유영저해가 관찰되었다. 48시간 경과시에 10,500과 20,000 ㎎/L 처리구에서는 모두 100% 유영저해개체가 관찰되었다. 처리 기간 중 음성대조군(0 mg/L)과 병저항성 GM벼와 낙동벼의 1,000 mg/L 처리구에서는 일반 중독 증상 및 특이증상은 관찰되지 않았다. 그러나, 병저항성 GM벼와 낙동벼의 1,000 mg/L 이상의 처리 농도 조건에서 일반 중독 증상인 수조 상단에서 유영 하는 개체가 관찰되었다(Table 5). 각 시험농도에서 품종간 물벼룩의 유영저해 개체수의 t-test 검정결과, 5,830, 0,500 및 20,000 mg/L 처리구에서 24시간후에는 각각
Cumulative immobility of Daphnia magna in non-Genetically modified (non-GM) rice (Nakdong) and Disease Resistant (OsCK1) rice
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병저항성 GM(OsCK1)벼와 낙동벼 급이에 따른 물벼룩의 급성독성
병저항성 GM벼와 낙동벼의 물벼룩 급성독성시험을 실시한 결과, 48시간-EC50은 낙동벼는 3,596.27 ㎎/L (95% 신뢰한계 : 1,889.99∼6,603.35 ㎎/L), 병저항성 GM벼는 3,147.18 ㎎/L (95% 신뢰한계 : 1,194.47∼6,916.50 ㎎/L)로 병저항성 GM벼가 다소 높은 급성독성을 보였으나, 95% 신뢰한계 구간 내의 차이로 유의성은 없는 것으로 나타났다. 무영향 농도는 두 품종 모두 1,800 mg/L으로 확인되었다(Table 6). 이는
EC50(Effective concentration 50) values of Daphnia magna afer 48 hours in non-Genetically modified (non-GM) rice (Nakdong) and Disease Resistant (OsCK1) rice
Thomas 등(2010)의
본 연구는 병저항성