참돔이리도바이러스병 (RSIVD, red seabream iridovirus dis - ease)은 1990년 일본 시코쿠 지역의 참돔 양식장에서 처음 발병 된 후, 매년 발병지역의 확산되고 있다(Inouye et al., 1992). 원인체가 되는 Megalocytiviruses는 major capsid protein (MCP) gene, adenosine triphosphatase (ATPase) gene 등을 사용한 계통적 분석에 의해 4개의 subgroup으로 분류되고 있다 (Imajoh et al., 2007). Subgroup 1은 RSIV를 포함하고 있으며, subgroup 2는 우리나라의 주요 병원체로서 돌돔( Oplegnathus fasciatus ) 등에 매년 대량 폐사를 유도하는 rock bream irido - virus (RBIV) 를 포함한다. Subgroup 3은 중국의 담수 식용어인 mandarin fish ( Siniperca chuatsi)에서 분리된 infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV)가 대표적이며, subgroup 4는 최근 넙치 ( Paralichthys olivaceus)와 터봇 (Scophthalmus maximus)에서 분리된 flounder iridovirus (FLIV)와 turbot reddish body iridovirus (TRBIV)을 포함하고 있다. 이러한 subgroup 중 최근까지 국내의 어류 양식장에서는 subgroup 2와 4에 의한 질병의 발생만이 보고되어 있다 (Do et al., 2005; Oh et al., 2006; Jeong et al., 2003).

패류는 여과섭식(filter-feeding)을 통해 먹이섭취를 하는 과정 중 norovirus 등의 human enteric virus 뿐만 아니라 marine birnavirus (MABV), white spot syndrome virus (WSSV) 와 같은 수생동물에 영향을 줄 수 있는 바이러스들이 중장선 (diges - tive gland)에 축적되어 존재하는 것이 보고되고 있다 (Atmar et al., 1995; Gerba et al., 1978; Goyal et al., 1979; Suzuki and Nojima, 1999; Vazquez-Boucard et al., 2010). 특히 Megalocytivirus는 국내에서 매년 주기적으로 발병하고 있으나 최근에야 국내에 서식하는 패류 내로의 축적 및 분석방법에 대한 접근이 겨우 이루어지고 있는 실정이다 (Kim et al., 2011). 더구나 현재까지 패류 내에 축적된 Megalocytivirus 의 유전적 분류에 대한 신속한 분석방법이 마련되지 않고 있어 보다 정밀한 패류내 바이러스의 위험성에 대한 유전적 정보가 충분히 이루어 지지 않고 있다.

현재 PCR 방법과 함께 자주 사용되고 있는 high-resolution melting (HRM) 기법은 PCR 수행시 intercalating fluorescent dye를 첨가하여 PCR과정에서 생성되는 amplicon에 결합 시키고, 이후 온도 상승을 줌으로써 target 부위의 염기서열에 따라서 각기 다른 형태로 나타나는 fluorescence signal의 변화 특성을 분석하는 방법이다(Kristensen and Dobrovic, 2008; Tajiri- Utagawa et al., 2008; Wittwer et al., 2003). 따라서 HRM 기법의 적용은 PCR target 부위에서의 variation을 보다 빠르고 손쉽게 구별함으로써 패류 내에 축적된 Megalocytivirus의 진단과 함께 subgroup까지의 유전적 특성을 분별 확인을 가능하게 하여 어류질병 발생과 패류 내 축적 원인체 간의 상관 관계를 확립 할 수 있게 한다.

본 연구에서는 Megalocytivirus 의 패류 중장선에의 축적을 확인 하고, 이들 바이러스의 유전적 분류를 위하여, MCP 유전자 부위에서 나타나는 유전적 변이 특성에 대해 HRM 기법을 적용하여 subgroup 을 확인하는 기법을 확립하고 국내 발생 RSIV 질병 원인체에 대한 유전적 의미를 보고하고자 한다.

본 실험에 사용된 굴은 2010년 3월 진하 (동해 지역) 및 2011년 3월 고성 (남해 지역)에서 채취한 굴(Crassostrea gigas) 그리고 2011년 9월 서산 (서해 지역)에서 바지락(Tapes philippinarum)을 채취하였다. 채취한 각각의 패류로부터 중장선을 각각 분리하여 -70 °C에 보관하면서 사용하였다.

2000년 9월에 남해안 양식장에서 Megalocytivirus에 감염된 돌돔 비장에서 분리한 IVS strain(subgroup 2, Jeong et al., 2003, GenBank accession numbers for ATPase gene : AF487899)과 2004년 국내로 수입되는 관상어 중 Megalocytivirus에 감염된 pearl gourami (Trichogaster leeri)의 비장에서 분리한 PGIV-K1 strain (subgroup 3, Jeong et al., 2008)을 숙주세포인 GF 세포 (ATCC CCL-58)에 접종하여 배양하였다. 배양방법으로 70-80% 배양된 단일 층의 GF 세포에 감염 비장 조직 마쇄액 200 μ L (10 mg/mL)를 접종하여 25 °C에서 배양하는 방법을 사용하였다. 2-3일 배양한 후 cytopathic effect (CPE)가 일어나 부착된 세포가 떨어지면 15mL tube에 회수하여 냉동과 해동의 과정을 3 번씩 수행한 후 1,500 × g 에서 10분간 원심 분리하여 상징액 1 mL 씩 분주하여서 -70 °C에 보관하여 사용하였다. 그리고 2010년 11월 포항 넙치 양식장에서 Megalocytivirus에 감염된 넙치의 비장으로부터 분리된 FLIV strain (subgroup 4)을 -70 °C에 보관하여 사용하였다.

패류의 중장선 50 mg 또는 배양된 바이러스 상등액 200 μ L로 부터 AccuPrep ® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)을 사용하여 제조사의 protocol에 따라서 DNA를 분리하여 50 μ L의 TE buffer에 현탁하였다. 분리된 DNA는 분광 광도계 (Eppendorf ® BioPhotometer)를 사용하여 흡광도 측정으로 A260/A280 nm값을 구하여 DNA의 양을 측정하였으며 실험 전 까지 -20 °C에서 보관하였다.

추출한 DNA를 template로 사용하여 1-step PCR (Applied Biosystems ® 2720 Thermal Cycler)를 아래와 같은 방법으로 실시하였다. 10 × PCR buffer 2 μ L, 200 μ M의 각각의 dNTP, 1 μ M의 sense primer와 1 μ M의 antisense primer (Table 1), Taq DNA polymerase (G-Taq DNA polymerase, Cosmogentech, Korea) 및 template 1 μ L를 첨가한 후 증류수로 최종액의 vol - ume이 20 μ L가 되도록 했다. PCR 혼합물은 94°C에서 3분간 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 30초 denaturation, 55°C에서 30초 annealing, 72°C에서 30초 extension 의 반응을 35cycle 수행 한 후 72 °C 에서 7분간 post-extension 시켰다. 2-step PCR amplification은 1-step PCR product 1 μ L를 template로 사용하여 위와 동일한 방법으로 실시하였다.

[Table 1.] Primers information used in this study

Primers information used in this study

PCR 후 증폭 산물은 0.5 μ g/ μ L EtBr (Ethidium Bromide)이 첨가된 2% agarose gel 을 이용하고, 1 × TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA)를 전기영동을 위한 완충액으로 하여 전기영동을 실시하였다. UV 검출기에서 나타나는 band를 관찰하여 그 증폭여부를 확인하였다.

각 지역에서 가장 뚜렷한 2-step PCR 양성을 보이는 시료를 하나씩 택하여 amplicon (280 bp)을 GeneAll ® Expin Gel SV kit (GeneAll Biotechnology, Korea)을 사용하여 정제하였으며, 정제된 DNA를 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 ligation 후 E. coli DH5 α 균주에 transformation 시켰다. Am - picillin (50 μ g/mL)과 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β - D-galactopyranoside, Sigma, USA; 40 μ g/mL)이 첨가된 LB (Luria-Bertani, Difco, USA) 평판배지에서 증식된 colonies (clones)를 무작위로 선택하여 LB broth 에 접종 후 37°C에서 24시간 배양하였다. 배양액으로부터 GeneAll ® Plasmid SV Mini kit (GeneAll Biotechnology, Korea)를 이용하여 plasmid DNA를 분리하였으며 이를 HRM 분석에 사용하였다.

Megalocytivirus의 sub-typing에 사용된 표준검정시료는 배양된 바이러스 (subgroup 2, IVS; subgroup 3, PGIV-K1) 과 FLIV (subgroup 4) 감염 넙치의 비장으로부터 추출된 DNA를 사용하였다. 그리고 Megalocytivirus 양성 패류의 중장선으로 부터 직접 추출한 DNA 또는 2-step PCR 생성물로부터 cloning하여 분리된 plasmid DNA를 HRM template로 사용하였다.

HRM을 시행하기 위한 반응액에는 10 × buffer 2 μ L, 200 μM 의 각각의 dNTP, 1 μ M의 forward와 reverse primer, EvaGreen (Bioyium, Korea) 1 μ L, Hot start Taq (HS prime Taq DNA polymerase, Genet Bio, Korea) 및 template 1 μ L를 첨가 후 증류수로 최종액의 volume이 20 μ L가 되도록 했다. HRM 분석은 Rotor-Gene^TM 6000 (Qiagen, Germany)을 사용하였고 아래와 같은 방법으로 실시하였다.

먼저 95°C에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 95 °C에서 10초 denaturation, 56°C에서 10초 annealing, 72°C에서 15초 extension의 반응을 45 cycle 수행하였다. 45 cycle이 끝난 후 80-90°C에서 0.1°C /s의 속도로 온도를 증가시키며 Tm (melting temperature) 값을 측정하였다.

채집된 패류 각 개체 별로 (18 개체) 분리된 DNA를 template로 하여 Megalocytivirus에 대해 PCR을 수행하였을 때 1-step PCR (35 cycles)에서 모두 음성의 결과를 보였으나, 2-step PCR (35 cycles) 수행 시 진하 굴 시료에서 50.0%, 고성 굴 시료에서 38.9%, 서산 바지락 시료에서 39.0% 의 시료에서 280 bp의 amplicon을 생성하는 양성률을 보여 지역간의 뚜렷한 차이는 나타나지 않았다.

HRM 분석기법의 최적화를 실시하기 위해서 Megalocytivirus의 subgroup 2 (IVS), subgroup 3 (PGIV-K1) 그리고 sub - group 4 (FLIV) 의 각각에 해당하는 표준검정시료를 대상으로 HRM 을 실시하였다. 현재 subgroup 1 은 우리나라, 일본 중국에서도 발견 되지 않으며 또한 새롭게 제시되고 있는 현재의 분류 체계에서는 subgroup 2에 포함하는 경우가 많으므로 여기서는 따로 구별하여 분석을 실시 하지 않았다

HRM을 수행한 결과, Megalocytivirus의 각 subgroup 별로 Tm값이 IVS의 경우 87.35°C, PGIV-K1의 경우 88.13°C, FLIV의 경우 87.90°C 차이가 나타났으며, 증폭된 산물의 염기서열 차이에 따라서 감소하는 형광 값이 차이가 났다. 그리고 감소 하는 형광 값을 normalized fluorescence로 변환하였을 때 sub - group별로 구별이 가능하였다(Fig. 1).

[Fig. 1.] Genetic differentiation of the reference Megalocytiviruses using high-resolution melting (HRM) analysis.

Megalocytivirus 양성 개체로부터 분리된 DNA 를 직접 tem - plate으로 하여 HRM을 수행할 경우 PCR 증폭이 이루어지지 않아 melting-curve의 분석을 할 수 없었다. 하지만 2-step PCR 생성물로부터 cloning하여 분리된 plasmid DNA를 template로 하여 HRM을 실시하였을 때 표준양성시료와 동일한 Tm값을 확인할 수 있었으며 subgroup 분석이 가능하였다. HRM을 수행한 모든 양성 시료에서 Megalocytivirus subgroup 2 와 subgroup 4 가 존재하고 있음을 확인 할 수 있었으며, 나타난 subgroup 들의 비율은 시료 별로 차이가 나고 있었다. 2010년 3월 진하 굴 내의 Megalocytiviruses (JHOy1003)의 경우 분석된 6개의 clones 중 5개가 subgroup 4, 1개가 subgroup 2 에 속하는 것으로 나타났으며, 2011 년 3 월 고성 굴 내의 Megalocytiviruses (GSOy1103) 의 경우 분석된 5 개의 clones 중 2 개가 subgroup 4에, 3개가 subgroup 2로 나타났다. 그리고 2011년 9월 서산 바지락 내의 Megalocytiviruses (SSC1109)의 경우 분석된 7개의 clones 중 1개가 subgroup 4, 6개가 subgroup 2에 속하는 것으로 나타났다(Fig. 2, Table 2). 또한, HRM 분석에 사용된 plasmid DNA를 염기서열 분석을 통해 subgroup을 확인한 결과 HRM 결과와 일치하고 있음을 알 수 있었으며, 국내 Megalocytiviruses에서는 동일 subgroup내에서의 유전적 variation이 매우 제한적으로 일어나고 있음을 확인 할 수 있었다(Fig. 3).

[Table 2.] Distribution of subgroups in Megalocytivirus obtained from shellfish based on differentiation by high-resolution melting analysis.

Distribution of subgroups in Megalocytivirus obtained from shellfish based on differentiation by high-resolution melting analysis.

[Fig. 2.] Differentiation of the Megalocytivirus subgroups using high-resolution melting (HRM) analysis. Amplicons of the MCP gene of Megalocytiviruse s in 2-step PCR from shellfish were cloned. Each purified plasmid from 5~7 separated colonies grown on a single cloning plate were used for HRM analysis.

패류의 여과섭식을 통한 먹이섭취 과정 중 축적된 norovirus 등의 human enteric virus에 대한 분석 방법은 많은 연구에 의해 보고되고 있으며, 수생동물에 영향을 줄 수 있는 바이러스인 MABV, WSSV의 패류 조직 내에서의 축적도 보고되고 있다(Atmar et al., 1995; Gerba et al., 1978; Goyal et al., 1979; Suzuki and Nojima, 1999; Vazquez-Boucard et al., 2010). 또한 Megalocytivirus의 패류 내 축적은 추출 방법론적인 부분만 이루어져 있고 정확한 감염의 생태적 상황, 그리고 병원체에 대한 빠르고 신속한 새로운 유전적 비교 방법에 대한 결과는 아직 미진한 상태에 있다(Kim et al., 2011).

현재까지 감염 어류를 대상으로 하여 국내에서 보고된 Megalocytivirus의 subgroup은 돌돔 등의 돔류에서 보고된 subgroup 2와 넙치, 터봇에서 보고된 subgroup 4의 두 종류이며 아직 subgroup 1과 subgroup 3은 보고되지 않고 있다.

따라서 feeding-activity를 가지는 패류에 오염된 Megalocytivirus의 유전적 특성 규명은 주변 수권에서의 질병 발생과의 연관 관계 추적 및 어류 양식산업에 있어서 본 바이러스의 위험성 재고 측면에서 매우 의미 있는 정보라고 할 수 있을 것이다. 다만 여기서 명확히 하여야 할 것은 현재는 subgroup 2는 subgroup 1을 포함 한다는 분류가 일반적으로 받아들여지고 있으며 (Kurita and Nakajima, 2012), 또한 현재까지 한, 중, 일의 최근 10 년간의 보고에서 subgroup 1에 대한 질병 보고가 없었으며 (Imajoh et al., 2007) subgroup 1과 subgroup 2의 구별은 큰 의미를 부여하기 어려우므로 본 연구에서 subgroup 1과 subgroup 3로 나누어 논하고 있는 Megalocytivirus는 실질적인 측면에서는 새로운 개념으로 받아들여지고 있는 subgroup 3라는 하나의 의미로 이해 되는 것도 가능 할 것으로 추정 된다.

일반적으로 패류의 중장선에 축적된 바이러스 particles 수는 감염 어류에 비해 적고 또한 유전적으로 유사한 다양한 subgroup의 Megalocytivirus strains가 축적될 수 있기 때문에 특이적인 primer를 사용한 PCR 에서 나타난 amplicon을 분석하는 것은 그 virus의 다양성 분석에는 충분한 의미를 부여하지 못한다. 그러므로 다양한 viral strains 모두에서 나타나는 conserved genomic region에 대한 primer를 사용한 PCR을 실시 한 후 생성된 amplicon의 유전적 특성 또는 variation을 분석하면 detection 된 strains 모두를 분석 할 수 있는 것과 같은 의미를 지니는 빠르고 간편한 방법의 활용이 필요하다.

HRM은 PCR의 증폭산물로부터 target이 되는 유전자의 유전적 다양성을 신속하고 효율적으로 확인할 수 있는 기술로 mutant나 variation 부위를 확인할 수 있다(Kristensen and Dobrovic, 2008; Tajiri-Utagawa et al., 2008; Wittwer et al., 2003). 따라서 본 연구에서는 Megalocytivirus의 MCP gene을 target으로 한 HRM 기법을 사용하여 패류 내에 축적된 Megalocytivirus의 subgroup의 분석을 유전자 염기 배열 분석 없이 보다 빠르고, 간단하며, 편리하게 실시하고자 하였다.

일반적으로 패류에 축적된 바이러스는 양적 문제뿐만 아니라 다른 유전자형의 바이러스가 동시에 존재하기 때문에 조직 DNA를 주형으로 한 PCR amplicon에 대한 HRM의 직접적인 적용은 힘들다. 따라서 본 연구에서는 4종의 subgroup의 MCP 유전자부위에서 conserved region을 target으로 한 새로운 primer를 제작하고 이를 사용하여 2-step PCR을 실시한 후 결과물로 나타난 amplicon을 pGEM-T Easy vector에 cloning하였다. 나타난 clones를 무작위로 선별하여 plasmid를 분리한 후 cloned MCP gene에 대한 PCR amplicon의 variation에 대한 HRM 분석을 실시하여 subgroup을 확인하였다. 그 결과, 모든 양성 시료에는 subgroup 2와 subgroup 4가 함께 존재하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 subgroup 1과 subgroup 3는 검출되지 않아 아직까지의 국내 발병사례에서 이 두 가지 type에 의한 사례가 보고된 바 없다는 결과와 일치함을 알 수 있었다. 본 연구에서 비록 subgroup 1에 대한 HRM은 따로 실시하지 않았으나 gene sequence analysis에서 subgroup 1로 분류 할 수 있는 clones는 없었다 (Fig. 3). 그러므로 우리나라의 수권은 우리나라 양식현장에서 나타나는 subgroup 2와 subgroup 4 두 가지 types에 노출 되어 있으며, 아직 subgroup 1과 subgroup 3은 우리나라 양식현장의 수권에서 비상존성 바이러스 종 (exotic species)으로 분류 할 수 있음을 확인 할 수 있었다. 향후 수입 수산물의 검역에서 이에 대한 보다 정밀한 분석이 항상 이루어져 새로운 subgroup의 국내 유입 방지책이 있어야 할 것이다.

[Fig. 3.] Nucleotide sequence alignment of the MCP genes of Megalocytiviruses in shellfish. Each cloned plasmid was purified from colonies on plate used for cloning of MCP gene amplicons in 2-step PCR and used for determination of nucleotide sequence.

더욱 흥미로운 것은 시료를 채취한 지역별로 나타난 subgroup들의 비율이 차이가 있다는 것이었다. JHOy1003 로부터 의 2-step PCR amplicon-clones 중에는 subgroup 4가 83.3%의 비율로 나타났고, SSC1109로 부터의 2-step PCR amplicon- clones 중에는 subgroup 2가 85.7% 의 비율을 차지하고 있어 동해지역(진하)은 subgroup 4, 서해지역(서산)은 subgroup 2가 각각 우점적임을 확인 할 수 있었다. 그리고 GSOy1103로 부터의 2-step PCR amplicon-clones 중에는 subgroup 2가 60%, subgroup 4가 40% 로 나타나 남해지역(고성)은 subgroup 2와 subgroup 4가 서로 유사한 비율로 나타나고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 주변 양식 환경에 따라 넙치양식이 주를 이루고 있는 동해 지역의 경우 넙치에 감염되는 FLIV가 굴에 축적되어서 나타난다고 생각 되어지며 또한 동해지역과는 달리 남해 지역과 서해 지역의 경우 넙치 양식뿐만 아니라 돌돔 양식을 포함하여 다양한 어종의 양식이 이루어지고 있으므로 subgroup 2와 subgroup 4에 속하는 바이러스가 매년 어류에서 발생하여 수권으로 유출되어 패류 내로 축적되고 있는 것으로 확인되어졌다. 기법적으로 보면 염기서열 분석 결과와 본 연구의 HRM 결과와 비교하였을 때 결정 된 subgroup들은 서로 동일한 결과를 보였으며(Fig. 3), 이러한 결과를 통하여 Megalocytivirus의 subgroup 분석에 있어서 HRM 분석기법이 기존의 염기서열 분석법보다 신속하고 효율적임을 확인 할 수 있었다.

결론적으로 국내에 서식하고 있는 패류의 중장선 내에서 Megalocytivirus의 오염 존재의 확인과 함께 subgroup의 결정을 위한 HRM 분석 방법을 제안할 수 있었으며, Megalocytivirus 양성 패류의 중장선 내에는 subgroup 2, subgroup 4가 존재하고 있음을 확인 할 수 있었다. 향후 패류 및 어류 내 감염 바이러스의 진단 및 유전적 분석을 위하여 본 연구의 HRM 기법의 응용은 한 단계 진보된 기법임을 확인하였다.