The Rhizoctonia blight causing by
한지형잔디(cool season turfgrass)와 난지형잔디(warm season turfgrass)에 발생하는 패취형태의 잔디마름병인 Rhizoctonia blight는
우리나라에서 Rhizoctonia 마름병을 방제를 위하여 현재 등록된 살균제는 단일계통의 단일농약과 계통간의 혼합제제를 합해서 38종의 살균제가 있다(Fungicide list in Korea, 2013). 이들 살균제들은 갈색잎마름병, 갈색마름병 및 갈색퍼짐병을 동시에 방제하거나, 단독 방제하는 것으로 등록이 되어 있는 경우도 있고, 아울러 녹병, 탄저병, 동전마름병과도 동시에 방제할 수 있도록 등록이 된 약제들도 있다. 이들 약제 중에도 계통이 다른 3종의 침투성살균제인 아닐아드계인 flutolanil, 트리아졸계인 hexaconazole 및 스트로빌루린계통인 pyraclostrobin에 등록된 병명을 보면, flutolanil은 갈색잎마름병(춘고병)과 갈색퍼짐병에 등록이 되어 있고, hexaconazole은 달라스팟과 갈색마름병에 등록되어 있고, pyraclostrobin은 갈색잎마름병, 갈색퍼짐병, 달라스팟 및 피시움마름병에 등록이 되어 있다(Fungicide list in Korea, 2013).
이들 살균제들은 두 종류의 이상의 병을 방제하는 농약으로 등록되어 있지만, 침투성살균제로 동일 농약을 장기간 사용할 경우 병원균에 대한 살균제의 감수성이 저하되거나 또는 살균제에 대한 저항성을 나타내는 병원균들이 출현으로 인하여 병 방제 효과가 낮아질 수도 있다(Couch et al., 1990). 미국은 골프장에서 동전마름병을 방제하기 위하여 사용한 결과, 1983년부터 여러 약제에 대하여 저항성이 보고 되었으나(Golembiewski et al., 1995; Hsiang et al., 1997), 국내에서는 동전마름병과
본 시험은 골프장에
본시험에 사용된 3종의 병원균인
병원균의 순수분리를 위해서는 샘플에서 분리한 이병조직을 3% sodium hypochloride 용액에서 30초간 살균 후 살균수로 세척하고, 다시 70% 알코올 30초간 살균한 후 멸균수에 침지하여 세척한 후, streptomycin 100 mg과 ampicillin 1000 mg·L-1을 첨가한 PDA (potato dextrose agar: Difco Laboratories) 배지 위에 치상 하였다. Petri dishes는 파라 필름으로 밀봉하여 25°C 인큐베이터에서 배양하였다. 순수분리를 위하여 이병조직에서 자라는 균사의 가장자리를 5 mm 크기의 균사조각을 잘라내어 위와 동일한 항생제가 함유된 PDA배지에 재 접종하여 배양하여 1차적으로 육안으로 균사와 균핵의 형태적인 관찰을 통하여 시험용 균주를 선별한 후 최종 균주의 동정을 위하여 DNA를 추출하여 rDNA의 ITS 지역의 ITS5 and ITS4 프라머를 이용 염기서열분석을 통하여 최종적으로 확인하였고(Chang and Lee, 2013), 병원성 시험도 마친 균주로 본시험이 진행되는 동안 PDA 사면배지에서 배양하여 4°C에서 보관하면서 사용하였다.
본 실험에서 사용한 살균제는 골프장에서 여름철 병 방제용으로 자주 사용하는 침투성 살균제인 anilides 계인 flutolanil 유제(a.i. 15%), triazole 계통인 hexaconazole 액상수용제(a.i. 2%), 및 스트로빌루린계통인 pyraclostrobin 수용제(a.i. 25%)를 사용하였다(Table 1). 병원균은 골프장에서 분리한
[Table 1.] List of fungicides used in this study.
List of fungicides used in this study.
균사생장 억제율(%) = (살균제 무처리 PDA배지에 자란 균총의 지름 −살균제 처리 PDA배지 균총의 지름) /살균제 무처리 PDA배지에 자란 균총의 지름 × 100
각각 살균제에 대한 3 종류 병원균의 EC50 값과 상대적인 균사에 대한 상관성 관계분석은 최저 EC50 값과 최고 EC50 값을 이용하여 아래와 같이 산출하였다.
상대적인 균사생장 = (최저 EC50 값 −최고 EC50 값) /최저 EC50 값
두 살균제의 혼용에 의한 살균제 감수성은 다음과 같이 평가하였다. Flutolanil, hexaconazole 및 pyraclostrobin 살균제를 이용하여 각각 살균제에 대한 3종의 병원균인
병원균의 접종은 25°C에서 2일간 배양한 균총의 가장자리로부터 직경 5 mm 크기의 균사 조각으로 떼어 내어 살균제 혼용 배지에 올려놓고, 밀봉 후 25°C 인큐베이터에서 3일에서 5일간(
Rhizoctonia 마름병을 일으키는 3종류의 병원균에 대한 살균제의 감수성을 조사하기 위하여 침투성 살균제인 anilides계의 flutolanil, DMI계의 hexaconazole 및 strobilurin계의 pyraclostrobin을 이용하여 균사의 상대적인 생장을 효과적으로 50% 억제하는 농도인 EC50 값을 구한 결과는 Table 2와 같다.
In vitro fungicide sensitivities of effective concentration inhibiting by 50% of mycelial growth of three three Rhizoctonia species.
3종의 살균제에 대한
각각 살균제에 대하여 3종류의 병원균의 EC50 값과 살균제의 감수성 사이에 연관관계를 분석한 결과 Fig. 1과 같이 flutolanil과 pyraclostrobin 살균제에서 통계적인 유의성의 차이를 보였다. 두 살균제의 감수성 반응을 보면, 3 종류의 병원균 모두가 EC50 값이 높은 균일수록 상대적인 균사생장이 증가하는 상관관계가 나타나는 것을 볼 수 있었다. 반면, hexaconazole 살균제에서는 3종 병원균과의 상관관계가 나타나지 않았다.
Flutolanil은 0.05-0.072 μg a.i. ml-1농도에서 상대적인 균사생장 값은 평균 0.9349로 EC50 과의 상관관계가 0.5025로 통계적인 유의성(
살균제 함유 배지와 살균제를 함유하지 않은 배지에 대한 3종의 병원균에 대한 살균제의 감수성 정도를 파악하기 위하여 병원균의 상대적인 균사생장 값은 살균제가 효과적으로 3종의 병원균에 대하여 50%를 억제하는 농도로 평가를 하고 있다(Detweiler et al., 1983). EC50 값을 실내에서 조사하는 것은 포장에서 병 방제를 위한 살균제의 효과를 예측할 수 있을 좋은 방법인 동시에 장기적으로 포장에서 약제에 대한 저항성 병원균의 출현을 예측 하는데 좋은 방법이 되기도 한다(Jo et al., 2006). Rhizoctonia 마름병을 유발하는
추후 시험에서는 여러 포장에서 많은 병원균을 분리를 하여 이들 살균제에 대한 감수성의 정도를 조사 할 필요성을 이번 시험을 통해서 알게 됨으로서 지속인 모니터링이 필요할 것으로 생각한다.
Jo et al. (2006)에 의하면 동전마름병 방제를 위해서 hexaconazole과 동일 계통인 propiconazole 살균제를 사용한 골프장에서 분리한 균주에 대한 EC50 값이 0.17 μg a.i. ml-1로 baseline 균주 보다 100-200배 정도 높은 것으로 조사됨으로서 propiconazole 을 사용한 골프장에서는 살균제의 효과를 저하시킬 수 있다고 하였으며, Putman et al. (2010)은 동전마름병에 propiconazole 살균제에 대한 baseline 균주의 EC50 이 0.0016 μg a.i. ml-1이었지만, 동일 살균제를 사용한 골프장에서 분리한 동점마름병원균의 EC50 는 높게 나타나 저항성이 나타날 가능성을 제시하였으며, 또한 동일 골프장에서 살균제의 감수성 정도가 다양하다고 하였다.
Hexaconazole, propiconazole과 tebuconazole은 작용 기작은 모두 지상부 침투성 triazole계 살균제로 sterol 생합성을 저해하는 작용 기작을 갖고 있어 장기간 사용하면 대상 병원균에 따라 약제에 대한 저항성을 유발하여 방제효과가 낮아지게 된다(Burpee, 1995; Smith et al., 1989). 이들 약제들은 설부소립균핵병, 동전마름병 및
본시험에서 사용한 약제 중 hexaconazole 살균제는 국내에서 여름철 동전마름병과
살균제에 대한 저항성병원균의 출현은 포장에서 해당 병에 대한 방제 효과를 줄이고, 관리비용을 높인다. 골프장에서 살균제 저항성은 1960년 후반에 Benzimidazoles계의 살균제가 소개되면서 benomyl과 thiophanate-methyl 살균제에 대한 자낭균류인 동전마름병에 대한 저항성 균주가 미국 여러 주에서 발견되었다(Cole et al., 1968). 그 이후 새로운 계통의 살균제인 dicarboximides에 대한 동전마름병에 대한 저항성이 1980년대에 보고 되었고(Detweiler et al., 1983), demethylation inhibitors (DMIs) 살균제인 propiconazole에 대한 저항성이 나타난 것은 이 살균제를 사용 후 10년 뒤인 1990년대에 처음보고가 되었다(Vargas et al., 1992).
3종의 살균제를 서로 다른 계통간에 감수성 정도에 대한 상관 관계를 조사하고자 3종의 병원균을 이용하여 두 그룹 간의 상관관계를 비교분석을 하였다(Fig. 3). Triazole계인 hexaconazole 과 anilides계인 flutolanil 간의 R2 값이 0.4761로 상관 관계가(
본시험에서 3종의 살균제에 대한 감수성 정도 간에 상관 관계가 있는 지를 살펴봄으로써 두 그룹 간의 교차 저항성 발현 여부 가능성을 알아 볼 수 있었다. 계통이 다른 약제 간에 혼용에 의한 조사대상 균주에 대한 감수성의 정도에서 상관관계가 나타나지 않음으로써 여름철 빈번히 사용하는 약제들이 아직은 설부소립균핵 병원균에 대하여 교차 저항성을 반응이 보이지 않고 있음을 알 수 있었다.
Hsiang et al. (1997)은 동전마름병 균주에서 propiconazole과 tebuconazole 두 약제간에 교차저항성은 나타나지 않았으나, tebuconazole과 mycobutanol 및 mycobutanol과 propiconazole 살균제 사이에서는 교차저항성이 나타났다. 이들 DMI 살균제인 propiconazole 과 tebuconazole은 미국이나 캐나다에서 잔디에 사용 등록이 되어 많이 사용하고 있으며, 이들 살균제는 오랫동안 사용함에 따라 교차저항성을 나타냄으로 동전마름병에 대한 살균제 반응 baseline과 살균제 감수성 모니터링 연구가 많이 수행되어 가치있는 정보를 제공하고 있을 뿐만 아니라 살균제 저항성 작용 위원회에서 별도 분리가 되어 있을 정도로 중요하게 다루어지고 있는 살균제이다(Brent, 1995).
두 살균제의 혼용에 대한 3종의 병원균에 대하여 살균제의 혼용에 대한 상승효과를 조사하기 위하여 실시하였다. EC50 농도의 두 살균제를 혼용한 배지에서 균사생장 억제율은 혼용농약의 종류 보다는 병원균의 종류에 따라서 Fig. 3과 같이 통계적인 유의성의 차이를 보였다.
살균제는 병원균에 대한 방제효과를 높이고, 저항성병원균의 출현을 방지하기 위하여 작용 기작이 서로 다른 두 살균제를 혼용하여 새로운 제형을 만들어서 등록이 되고 있다(Fungicide list in Korea, 2013).
본시험에서 살균제의 혼용에 대한 상승효과는 조사하기 위하여 실시한 시험에서 두 약제를 해당병원균에 대한 EC50값의 농도로 혼용하여 상대적인 균사생장 억제율 조사에서 병원균간에 큰 차이를 보이는 것을 알 수 있었다. 병원균의 종류에 따라서 살균의 감수성의 차이가 현저하게 나타난 것을 관찰할 수 있었다. 이는 포장에서 두 살균제를 혼용하였을 때 병 방제에 대한 상승 효과가 나타나지 않을 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 이는 이 시험에 사용한 균들이 이미 살균제에 노출이 되어서 감수성이 낮은것인지 아니면 살균의 상승효과가 없다는 것인지를 구체적인 연구가 추후에 필요할 것으로 보여주는 것으로 생각되므로 해당 병원균에 대하여 보다 많은 균주를 이용하여 조사하여 볼 필요가 있다고 생각한다.
국내 골프장에서 발생하는 여름철병은 본시험에 사용된 살균제를 이용하여 여러 병을 동시에 방제하기 위하여 자주 사용하는 살균제로 아직까지는 저항성 병원균의 출현보고는 없지만 감수성이 낮은 경향은 보이고 있어, 동전마름병과
본 연구 결과