한약재를 비롯한 천연 생약재는 이미 오래 전부터 질병치료 및 예방, 건강증진 등의 생리활성을 위해 사용되어 왔으며, 특히 항균활성을 가지는 물질에 대한 연구는 현재도 활발히 진행되고 있다. 천연물에 존재하는 항균물질은 그 대부분이 alkaloids, flavonoids, terpenoids, phenolic compounds, quinones 및 volatile oils 등의 이차 대사산물이거나 그 유도체들로 알려져 있다 (Mitscher et al., 1980; Lee and Shin, 1991). 여러 나라에서는 예로부터 이용되어 왔던 여러 한약재의 약리작용, 특히 항균효과에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 국내에서 천연물로부터 항균성물질의 개발에 관한 연구는 주로 의약품과 천연보존제의 용도로 단백질, 유기산, 지방산, 향신료, 생약추출성분 등을 대상으로 주로 이루어져 왔다(Beuchat et al., 1989; Han et al., 2001; Lee, 2003). 이러한 천연물 유래 항균물질은 항생제나 합성 화학요법제에 비해 생체 안전성이 높고 내성세균에 대한 출현 우려가 적다는 장점이 있다(Cho et al., 2003). 그러나 이러한 천연항균 물질의 항균효과는 합성된 항생제에 비해 효과가 뛰어나지 않기 때문에 아직까지 실용화되는 경우는 많지 않은 실정이다.

한편, 증가추세에 있는 어류 질병들은 양식산업의 발달과 연안 환경오염 등으로 인해 더욱 가중되고 있으며, 우리나라 양식산업이 직면한 큰 문제중의 하나이다(Kang, 2005). 양식 어류에 발생하는 주요 세균성 질병은 어종에 따라 차이는 있지만 주로 활주세균증, 에드와드병, 비브리오증, 연쇄구균증, 장관백탁증 등이 알려져 있다(Edward, 2000). 이 중 넙치의 자어기에 주로 발병하는 장관백탁증의 원인균인 Vibrio ichthyoenteri는 부화 후 25-30일령의 자어에 발생하여 단기간에 거의 전멸에 가까운 피해를 주는 질병으로, 장의 점막 상피에 감염하여 점막의 괴사, 박리, 소화관의 백탁, 복부함몰 등의 증상을 나타낸다 (Muroga, 2001). 또한 Streptococcus iniae는 넙치, 무지개송어 등 다양한 어종에서 베타 용혈성 연쇄구균증을 유발하는 전염성 어병세균으로 병원성이 강하며 이로 인한 경제적 손실이 크다. 이 세균에 감염된 넙치는 체색이상, 안구백탁, 출혈, 복부팽만, 신장비대 및 폐사를 일으킨다(Moon et al., 2009). 이러한 세균성 질병의 치료를 위해서 매년 평균 220톤 이상의 수산용 항생제가 사용되고 있으며 이 중 옥시테트라사이클린, 옥소린산, 에리스로마이신 등이 많이 사용되고 있다(Treves, 2000). 항생제 사용량의 증가와 내성 어병세균의 출현빈도와 내성 경향은 비례하고 있으며, 세균성 질병의 치료와 예방은 더욱 어려워져가고 있다(Heo et al., 2002).

따라서 본 연구에서는 주요 어병세균인 V. ichthyoenteri와 S. iniae에 대한 시판 한약재 추출물 19종의 항균활성을 검색하고, 이중에서 활성이 높은 오배자 추출물로부터 활성물질을 분석함으로써 항생제를 대체하거나 그 사용을 감소시킬 수 있는 어류질병 치료 약제로서의 가능성을 탐색하고자 하였다.

항균활성 대상균주는 Vibrio ichthyoenteri KCTC 12725와 Streptococcus iniae KCTC 3657를 각각 Korean Collection for Type Cultures (KCTC, Korea)에서 구입하여 V. ichthyoenteri는 Marine broth (Difco Co., USA)를, S. iniae는 Brain Heart Infusion broth (Difco Co., USA)에서 각각 배양하며 실험에 사용하였다.

한약재는 시중에서 유통되고 있는 것으로 대한생약제품(주)로부터 구입하여 사용하였다. 사용 한약재의 일반명과 학명, 사용한 부위는 Table 1에 나타내었다. 그 밖의 시약은 분석용 grade 및 Sigma Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다.

[Table 1.] Growth inhibiting activities of medicinal herb extracts against V. ichthyoenteri and S. iniae 1

Growth inhibiting activities of medicinal herb extracts against V. ichthyoenteri and S. iniae 1

시료 추출액의 조제는 각 한약재 별로 약재를 세절하고 잘게 부수어 3배(v/v)의 80% methanol을 첨가하여 혼합하여 24시간 실온에서 침지한 후, Whatman No. 2 (USA) 여과지로 2회 여과하였다. 추출액은 rotary vacuum evaporator로 40℃에서 감압 농축하여 용매를 완전제거였으며, 각각의 농축물을 다시 DMSO에 20 mg/mL의 농도로 용해시켜 각 세균 별 항균활성측정을 위한 stock solution으로 사용하였다.

한약재 80% methanol 추출물을 분획여두에서 극성을 달리하는 용매를 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, water의 순서로 순차적으로 분획한 후 분획물을 40℃ 수조의 rotary vacuum evaporator로 농축하여 용매를 완전히 제거하였다. 각 용매 별 농축물을 DMSO에 10 mg/mL의 농도로 용해시켜 -20℃에 보관하면서 대상균주에 대한 항균활성을 측정하였다.

항균활성 검색은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2009)의 표준방법에 따라 disk diffusion method를 사용하였다. 즉, 적정배지에서 하룻밤 배양한 대상균주 배양액 200μL를 한천 배지 상에 멸균된 면봉으로 3회에 걸쳐 고르게 도말하고 지름 8 mm paper disk (Avantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 올린 후, 각 추출물을 30 μL (고형물 600 μg)씩 흡수시켜 37℃의 incubator에서 18시간 배양 후 paper disc 주위의 생육 저해환의 크기를 측정하였다. 추출물의 각 어병세균에 대한 액체배지 상의 증식 억제효과는 배양배지에 추출물을 0, 50 및 100 μg/mL씩을 첨가하고 37℃에서 진탕배양하면서 배양 0시간부터 30시간까지 620 nm에서의 흡광도를 측정하여 관찰하였다.

추출물의 열 안정성을 알아보기 위해 시료를 membrane filter (0.2 μm, Whatman, USA)로 여과하여 eppendorf tube에 담고, 40℃, 60℃, 80℃의 heating block에서 각각 1시간 동안 열처리한 후 상온에 방치하여 열을 식힌 후, disc diffusion method을 이용하여 가열 후의 잔류 활성을 측정하였다.

추출물의 최소 증식 저해 농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)는 96-well plate와 Muller-Hinton 배지(Difco Co., USA)를 이용한 표준 2배 희석 방법으로 측정하였다(Lee et al., 2003). 37℃에서 24시간 배양한 후 대상 세균의 생육이 저해된 최저 농도를 MIC로 결정하였다.

본 연구에 사용한 V. ichthyoenteri KCTC12725 균주는 원래 넙치(Paralichthys olivaceus)에서 분리된 어병세균으로 1996년 보고된 표준균주이며, S. iniae KCTC3657 균주는 1976년에 보고된 아마존강 담수 돌고래(Inia geoffrensis)에서 분리된 beta-hemolysin을 생산하는 병원성 표준균주이다. 어병세균 V. ichthyoenteri와 S. iniae에 대한 19종의 한약재 methanol 추출물의 항균활성을 disc diffusion method로 측정한 결과는 Table 1과 Fig. 1에 나타내었다. 리기다소나무, 몰약, 포도나무, 현삼 추출물에서 V. ichthyoenteri에 대한 항균활성이 나타났으며, 개여뀌, 몰약, 붉은대동여뀌, 오배자, 원화, 포도나무, 현삼추출물에서 S. iniae에 대해 항균활성을 나타내었다. 이들 중 오배자 추출물에서 V. ichthyoenteri와 S. iniae 모두에서 가장 높은 항균 활성을 나타내었다(Table 1). 이는 오배자 추출물이 Edwardsiella tarda, Escherichia coli, Bacillus subtilis, S. iniae에 대해 항균활성을 나타내었다는 보고와 유사한 결과이다(Lee et al., 1997; Choi et al., 2005; Kim et al., 2011).

[Fig. 1.] Antibacterial activity of 80% methanol extracts of several medicinal herbs against V. ichthyoenteri (A) and S. iniae (B). 1. Aster yomena, 2. Rhus javanica, 3. Erysimum aurantiacum, 4. Rosa multifl ora, 5. Zea mays, 6. Lespedeza cuneata, C, DMSO as negative control.

항균성에서 가장 높은 결과를 보인 오배자 80% methanol 추출물의 각 어병세균에 대한 증식 억제효과를 살펴보기 위해 배양배지에 0, 50 및 100 μg/mL씩을 첨가하여 생육정도를 흡광도를 통해 측정하였다(Fig. 2.). 접종초기부터 배양 30시간까지 관찰한 결과, V. ichthyoenteri와 S. iniae 모두 100 μg/mL 첨가군에서는 생육이 거의 저지되었다. 50 μg/mL 첨가군에서는 V. ichthyoenteri의 경우에 약 80% 가량, S. iniae의 경우에 약 50% 가량의 생육저지 효과를 나타내어, 오배자 추출물은 V. ichthyoenteri에 더 효과를 보이는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 배양 30시간까지 지속되었다.

[Fig. 2.] Effect of methanol extract of R. javanica (○; 0 μg/mL, ●; 50 μg/mL, □; 100 μg/mL) on the growth of V. ichthyoenteri (A) and S. iniae (B).

오배자 80% methanol 추출물의 V. ichthyoenteri와 S. iniae에 대한 최소생육저해농도(Minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정한 결과, V. ichthyoenteri에 대해서는 32 μg/mL, S. iniae에 대해서는 128 μg/mL로 나타났다(Table 2). 이 결과는 오배자 추출물을 MIC 농도만큼 사용하였을 경우에 병원성균주의 성장을 저해시킬 수 있음을 의미하며, S. iniae보다는 V. ichthyoenteri의 경우에 4배 정도 더 효과적으로 활용할 수 있음을 알 수 있다. 이는 Fig. 2의 결과에서 V. ichthyoenteri가 오배자 추출물에 더 민감하다는 결과와 일치한다. 또한 오배자 methanol 추출물이 S. aureus에 대해 60 μg/mL, Salmonella gallinarum에 대해 120 μg/mL, 대장균에 대해 80 μg/mL, E. tarda에 대해 64 μg/mL이라는 여러 보고들의 MIC 수치들과 유사하거나 약간 강한 활성을 나타내었다(Cho et al., 2003; Choi et al., 2002; Kim et al., 2011). 오배자 methanol 추출물 시료가 정제도가 낮아 활성지표성분이 다른 성분들과 섞여 있는 조추출물임을 감안할 때, 보다 정제되어 단일 물질화 하였을 경우에는 상당히 낮은 농도에서도 V. ichthyoenteri와 S. iniae에 대한 저해능을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

[Table 2.] Minimal inhibitory concentration of 80% methanol extract from R. javanica

Minimal inhibitory concentration of 80% methanol extract from R. javanica

오배자 80% methanol 추출물의 열 안정성을 조사하기 위해 추출물을 10 mg/mL농도로 DMSO에 녹이고 heating block에서 40℃, 60℃, 80℃에서 각각 1시간 동안 열처리 한 후 disk diffusion assay를 실시하여 생육 저해환을 측정하였다(Fig. 3). 그 결과 오배자 추출물은 각 처리 온도 별로 추출물의 활성에 변함이 없는 것이 관찰되었으며, 이는 오배자 추출물의 항균활성 성분이 80℃까지의 열에 대해서는 안정함을 의미한다. 열에 안정한 항균활성 성분은 식품, 사료, 첨가물 제조 등 가열 처리가 필수적인 공정인 제품을 제조하는 경우를 포함하여 산업적으로 활용할 경우에 활성성분의 장점으로 적용될 수 있다고 판단된다.

[Fig. 3.] Effect of heat treatment on antibacterial activities of 80% methanol extract from R. javanica against V. ichthyoenteri (A) and S. iniae (B). Each methanol extracts (10 μg/mL) from R. javanica was used after no-heat treatment (1), heating at 40℃ for 1 h (2), at 60℃ for 1 h (3), and at 80℃ for 1 h (4).

오배자의 methanol 추출물을 분획여두에서 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, 그리고 물로 용매의 극성에 따라 순차적으로 분획하여 각각의 유기용매 가용 분획을 얻었다. 각 분획물의 항균활성을 disk diffusion method에 따라 항균활성을 측정한 결과 모든 분획에서 어병세균 두 균주에 대해 활성을 나타내었으며, V. ichthyoenteri에 대해서는 각 분획물 모두에서 S. iniae보다 높은 활성을 나타내었다. 그 중 ethyl acetate 분획 층에서 두 균주 모두에 대해 가장 높은 활성을 나타내었으며, 같이 비교한 methanol 추출물보다 그 활성이 높게 나타났다(Table 3).

[Table 3.] Antibacterial activities of various fractions from R. javanica

Antibacterial activities of various fractions from R. javanica

오배자는 진딧물과(Aphidae)에 속하는 곤충에 의해 붉나무와 같은 옻나무과(Anacardiaceae)에 형성된 충영으로, 우리나라의 경우 붉나무(Rhus javanica L.)에 오배자면충이 기생하여 이루어진 경우가 많다. 전통 한약재로 사용되어 온 오배자는 최근의 일련의 연구에 의해 항산화, 항균, 정장작용, 항암활성 등의 생리활성이 보고되고 있다(Jo et al., 2000). 오배자 추출물은 S. aureus와 Salmonella gallinarum에 대해 높은 항균활성을 나타내었으며, 열에 대해서도 안정한 결과를 보였다는 보고(Choi et al., 2002)가 있으며, 병원성 녹농균인 Pseudomonas aeruginosa와 여드름 원인세균인 Propionibacterium acnes에 대해서도 항균활성을 나타내었다는 보고(Cha et al., 2008) 등이 있으나, 구체적인 활성물질을 분리, 동정하고 이를 각 병원성 균주에 대해 항균활성을 측정한 보고는 드물다. 오배자 추출물을 이용하여 본 실험 결과에서 나타난 V. ichthyoenteri와 S. iniae에 대한 강한 항균활성은 어병세균을 대상으로 한 점에서 다른 결과와의 차별성을 나타낸다. 오배자의 어병세균에 대한 항균활성 물질을 분리 및 구조동정하고, 어병세균에 대한 항균 활성 메커니즘을 밝히고, 또한 어병세균에 대해 상용되고 있는 항생제와의 병용투여 효과 및 투여 조건 등에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.