The Experimental Study on Anti-inflammation and Anti-oxidation of Sopungdojeok-tang(Xiaofengdaochi-tang) and Samulsopungsan( Siwuxiaofeng-san)

消風導赤湯과 四物消風散의 항염 및 항산화 효과에 대한 실험적 연구

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  • ABSTRACT

    Objective

    This experimental study was performed to investigate the anti-inflammation and anti-oxidant effects of Sopungdojeok-tang(SPDJT) and Samulsopung-san(SMSPS) which were used to treat patient with atopic dermatitis

    Methods

    Anti-inflammation and anti-oxidant effects of SPDJT and SMSPS were measured by the inhibitory ability of Nitric oxide(NO) production and the scavenging for 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl( DPPH) radical.

    Results

    1. SPDJT and SMSPS were not showed cell toxicity.

    2. In inhibitory effects against NO production, all groups of SPDJT were showed anti-inflammation, but all groups of SMSPS were not showed anti-inflammation. There were statistical significances between 20㎍/㎖ and 4, 10㎍/㎖ in SPDJT groups.

    3.In DPPH radical scavenging activity, all groups of SPDJT and all groups of SMSPS were showed anti-oxidant effects. There were statistical significances between 20㎍/㎖ SPDJT group and 4, 10㎍/㎖ SMSPS groups.

    Conclusion

    These results suggest that the SPDJT groups are better than the SMSPS groups in antiinflammation and anti-oxidant effects.


  • KEYWORD

    Sopungdojeok-tang , Samulsopung-san , Antiinflammation , anti-oxidation , NO , DPPH.

  • I. 緖論

    아토피피부염은 과거에 비해 증가하고 있는 피부질환으로1), 장기간 지속하여 10% 이상에서 성인기까지 지속될 수 있어 발달학적 시기의 환아들에게 정서적인 면에 많은 영향을 끼칠 수 있는 것으로 보고되고 있다2).

    아토피피부염의 임상 양상은 유아기, 소아기, 청소년기, 성인기의 연령에 따라 특징적으로 구분하여 기술하고 있다3). 그러나 이러한 구분은 아토피피부염의 진행 과정을 기간적으로 분류한 것일 뿐 임상적으론 각 시기별로 수포성 구진, 홍반, 부종, 삼출성 병변을 보이는 급성과 피부가 두꺼워지는 태선화 현상이 나타나는 만성의 양상으로 나눌 수 있다4).

    아토피 피부염은 습진의 한 분류에 해당하는 피부질환으로 한의학에서 胎瘡, 四彎風, 浸淫瘡의 범주에 해당 한다고 볼 수 있으며, 胎?瘡, 四彎風, 浸淫瘡은 임상양상을 홍반, 구진, 수포를 주로 하는 濕症과 인설, 가피, 피부 거침을 주로 하는 燥症으로 분류하고 있으며, 濕症은 급성의 양상과 燥症은 만성의 양상과 유사하다고 볼 수 있 다5).

    아토피 피부염과 관련된 최근의 한의학적 연구는 아토피 피부염에 사용될 수 있는 처방을 선택해서 NC/Nga Mice에 대해 실험하는 연구들로6-9) 급성 상태 또는 만성상태에 사용되는 처방들 중 하나만을 선택해서 실험하는 내용들로 서로 다른 양상에 사용되는 처방에 대해 유사한 실험적 방법과 내용으로 진행되고 있다. 이에 저자는 급성상태에 사용하는 처방인 消風導赤湯과 만성 상태에 사용하는 처방인 四物消風散10)을 이용하여 급성과 만성의 처방이 항염과 항산화에 있어 차이를 보이는지에 대한 간략한 실험을 진행하여 다음과 같이 보고하는 바이다.

    II. 實驗材料 및 方法

       1. 材料

    1) 약 물

    본 실험에 사용된 消風導赤湯(SPDJT)과 四物消風散 (SMSPS)의 한약재는 상지대학교부속한방병원에서 엄선하여 실험에 사용하였다(Table 1).

    2) 균주 및 세포주

    독성 및 항염에 사용된 RAW 264.7(Mouse Macrophage cell line) 세포주는 한림대학교 TIC(Technology Innovation Center)에서 분양 받아 사용하였다.

    3) 시약 및 기기

    실험에 사용한 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-gel)- 2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), Lipopolysaccharide( LPS), NG-methyl-L-arginine acetate salt(L-NMMA), 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl( DPPH) 시약들은 Sigma(USA)에서 구입하여 사 용하였으며, ELISA reader(Perkin-Elmer, Foster City, CA) 등의 기기를 실험에 사용하였다.

       2. 方法

    1) 시료조제

    SPDJT 81 g과 SMSPS 67 g을 각각 분쇄기를 이용하여 분말로 만들고 2차 증류수 1ℓ와 혼합하여 약탕기로 100℃에서 150분 동안 추출하고 회전감압농축기를 이용 완전 농축하고 동결 건조하여 각각 9.153 g(수율 11.3%), 7.102g(수율 10.6%)의 추출물을 얻었다. 추출물을 30 mM NaOH 용매제를 이용하여 20mg/㎖의 농도로 solution을 만들고 0.45㎛의 주사기 필터로 여과한 후 시험 농도로 희석하여 사용하였다.

    2) 균주 및 세포 배양

    RAW 264.7cell을 10% FBS(fetal bovine serum), penicillin(100units/㎖), streptomycin(100units/㎖)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Egale's medium) 배지로 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 배지는 3~4일 간격으로 교체하고 배양용기에 90%이상 자라게 되면 계대 배양하여 실험에 사용하였다11).

    3) 세포 독성 측정

    96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 RAW 264.7 cell을 접종하여 24 시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 각 시료의 농도가 4, 10, 20㎍/㎖가 되도록 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT 시약을 각 well에 첨가하고, 4시간 동안 항온기에서 반응시킨 후, MTT 시약이 함유된 배지를 제거하였다. 각 well에 100㎕ acid iso-propanol(0.04N HCl in iso-propanol)을 첨가하여 30분간 교반하여 주고, ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광값을 측정하였다12).

    4) NO 생성량 측정

    96 well plate에 5×104 cells/well의 농도로 RAW 264.7 세포를 접종한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 시료의 최종 농도가 각각 4, 10, 20㎍/㎖의 농도가 되도록 세포에 처리하고 염증 반응 유도 인자인 LPS를 100 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 배양 후 배지를 이용하여 Nitric oxide(NO)의 생성 정도를 측정하였다13). 96 well plate에 세포배양액 50㎕와 Griess 시약 50㎕를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광값을 측정하였다. 양성 대조군으로는 NO 생성 억제제인 L-NMMA를 50μM이 되도록 시험 시료와 같은 방법으로 처리하여 시험 시료의 NO 생성 저해능을 비교하였다.

    5) DPPH 자유 라디칼 제거능 측정

    DPPH의 환원성을 이용하여 시료의 DPPH 라디칼 소거효과를 측정하였다. DPPH를 메탄올에 용해시켜 0.1 mM DPPH 용액 1㎖에 시료를 각 농도별로 제조하여 1㎖씩 넣어주고 잘 혼합하여 준 후, 실온에서 10분간 반응 시킨 뒤 565㎚에서 흡광값을 측정하였다14).

    6) 통계분석

    모든 실험 결과는 평균±표준편차로 표기 하였고 통계 적 유의성은 SPSS(ver 10.0)를 이용하여 one-way ANOVA로 하였으며 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

    III. 實驗結果

       1. 세포 독성 평가

    세포 독성에 대해 실험한 결과, 4, 10, 20㎍/㎖ 농도의 SPDJT와 SMSPS 추출물은 독성을 나타내지 않았다 (Table 2).

       2. NO 생성량에 대한 평가

    항염효능에 대해 실험한 결과, SPDJT는 농도의존적인 항염효능을 보였으며, 20㎍/㎖ 농도에서 4, 10㎍/㎖와 유의성 있는 차이를 나타냈다. SMSPS는 항염효능을 보이지 않았다(Table 3).

    3. DPPH 자유 라디칼 제거능에 대한 평가

    항산화능에 대한 실험 결과, SPDJT와 SMSPS는 농도 의존적인 항산화능을 보였다. SPDJT 각 농도와 SMSPS 각 농도 사이에는 유의성은 없었으며, SPDJT 20㎍/㎖ 농도는 SMSPS 4, 10㎍/㎖와 유의성 있는 차이를 보였다(Table 4).

    IV. 考察

    아토피피부염은 유아와 소아기에 발생하는 만성의 재발성 피부염으로서 원인은 불분명하지만, 유전 인자와 환경 인자가 발병에 크게 관여하는 면역성 질환으로 임상양상은 연령에 따라 생후 2개월에서~2세 미만의 유아기, 2세~12세 미만의 소아기, 12세~20세의 청소년기, 20세 이후의 성인기로 구분되어 특징적인 증상들이 나타나고 있다3).

    그러나 이러한 구분은 아토피피부염의 진행 과정을 기간적으로 분류한 것이지 각 시기에 발생하는 아토피피부염을 의미하는 것이 아니다. 임상적으론 각 시기별로 수포성 구진, 홍반, 부종, 삼출성 병변을 보이는 급성과 피부가 두꺼워지는 태선화 현상이 나타나는 만성의 양상으로 나눌 수 있다4).

    한의학에는 아토피피부염이라는 질환과 동일시되는 병명은 없으나 洋方의 연령에 따라 구분되어 특징적으로 나타나는 임상 양상과 유사한 胎?瘡, 四彎風, 浸淫瘡과 같은 질환들이 있다. 胎?瘡은 유아기에 발생하는 아토피와 유사하며, 四彎風은 소아기에 발생하는 아토피와 유사하며, 浸淫瘡은 청소년기와 성인기에 발생하는 아토피와 유사하다고 할 수 있다. 胎?瘡, 四彎風, 浸淫瘡은 모두 홍반, 구진, 수포, 미란 등을 주로 하는 濕熱症과 인설, 가피, 피부 거침, 색소 침착 등을 주로 하는 燥熱症으로 임상적 양상을 분류하고 있다5).

    따라서 아토피피부염은 동일 시기에 있어서도 임상적인 양상에 따라 홍반, 구진, 수포, 미란 등의 염증을 주로 보이는 급성의 濕熱症인 경우에는 염증을 진정시키는 淸熱燥濕의 치료방법을 위주로 하고, 피부 거침, 색소 침착, 태선화 등을 주로 보이는 만성의 燥熱症인 경우에는 滋陰淸熱의 치료방법을 위주로 하여 치료에 접근하는 것이 보다 유익할 수 있으며, 임상적으로 효과적이라고 할 수 있다.

    활성산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비가역적인 파괴 작용을 함으로써 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌질환, 심장질환, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 자가면역질환 등의 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다15).

    피부표면에 상처가 나면 세포의 막이 공기에 노출되고 어떤 자극으로 인하여 산소가 활성산소로 변화하고, 불포화지방산과 결합해서 과산화지질이 만들어지면 조직이나 세포에 해롭게 작용하면서 상처 자리와 궤양면을 폐색시켜 치유를 방해함으로 상처가 빨리 낫지 못하고 지속적으로 오래가게 된다. 또한 활성산소는 체내의 불포화지방산과 결합하여 과산화지질을 형성하면 보습을 맡고 있는 피부 최상층부의 각층을 이루는 피부의 보습 기능을 빼앗아 보습 기능이 저하되어 피부염을 더욱 악화시키게 된다16).

    최근 아토피피부염과 관련된 한의학적 연구들은 급성 또는 만성의 아토피피부염에 사용될 수 있는 처방들 중 하나만을 선택해서 NC/Nga Mice에 대해 실험하는 연구6-9)들로 서로 다른 양상에 사용되는 처방에 대해 유사한 실험적 방법과 내용으로 진행되고 있다. 이에 저자는 급성 상태에 사용하는 처방인 消風導赤湯10)과 만성 상태에 사용하는 처방인 四物消風散10)을 이용하여 각 처방들이 항염과 항산화에 있어 차이를 보이는지에 대하여 알아보기 위하여 세포 독성, NO 생성 저해능을 통한 항염효과, DPPH 라디칼 소거능을 통한 항산화효과를 측정하였다.

    세포 독성에 대해 실험한 결과, 4, 10, 20㎍/㎖ 농도의 消風導赤湯과 四物消風散은 전혀 독성을 나타내지 않았다(Table 2).

    항염효능에 대해 실험한 결과, 消風導赤湯은 농도의존적인 항염효능을 보였으며, 20㎍/㎖ 농도에서 4, 10㎍/㎖와 유의성 있는 차이를 나타냈다. 반면 四物消風散은 전혀 항염효능을 보이지 않았다(Table 3). 결과적으로 消風導赤湯이 四物消風散에 비하여 항염효능이 뛰어나 급성적 증상을 보이는 경우에 사용하는 것이 효과적이라 사려된다.

    항산화능에 대한 실험 결과, 消風導赤湯은 4㎍/㎖에서 41.6±3.8, 10㎍/㎖에서 53.0±0.6, 20㎍/㎖에서 66.2±5.0, 四物消風散은 4㎍/㎖에서 9.4±1.1, 10㎍/㎖에서 20.3±18.3, 20㎍/㎖에서 41.2±24.9의 소거능을 보여 消風導赤湯과 四物消風散 모두 농도의존적인 항산화능을 보였다. 消風導赤湯 각 농도와 四物消風散각 농도 사이에는 유의성은 없었으며, 消風導赤湯20㎍/㎖ 농도에서 四物消風散4, 10㎍/㎖와 유의성 있는 차이를 보였다(Table 4). 결과적으로 급성의 증상에 사용하는 消風導赤湯의 항산화능이 四物消風散보다 뛰어났다.

    전체적으로 消風導赤湯이 四物消風散보다 항염 및 항산화능에서 보다 나은 결과를 보여 급성의 경우에 消風導赤湯을 사용하는 것이 효과적이라 판단되며, 四物消風散은 염증이 소실된 이후에 사용하는 것이 효과적일 수 있을 것으로 판단된다. 이러한 결과로 볼 때 임상적 경과에 따라 각 처방의 유효성이 다를 수 있다고 생각된다.

    V. 結論

    消風導赤湯과 四物消風散의 세포 독성, NO 생성 저해능을 통한 항염효과, DPPH 라디칼 소거능을 통한 항산화효과를 측정하는 실험을 하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

    1. 消風導赤湯과 四物消風散은 4, 10, 20㎍/㎖ 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.

    2. 消風導赤湯은 농도의존적인 항염효능을 보였으며, 20㎍/㎖ 농도에서 4, 10㎍/㎖와 유의성 있는 차이를 나타냈다. 반면 四物消風散은 전혀 항염효능을 보이지 않았다.

    3. 消風導赤湯와 四物消風散은 농도의존적인 항산화능을 보였으나, 消風導赤湯 각 농도와 四物消風散 각 농도 사이에는 유의성은 없었다. 消風導赤湯 20㎍/㎖ 농도에 서 四物消風散 4, 10㎍/㎖와 유의성 있는 차이를 보였다.

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  • [Table 1.] Prescription of SPDJT and SMSPS
    Prescription of SPDJT and SMSPS
  • [Table 2.] Effects of SPDJT and SMSPS on Cell Viability of RAW 264.7 Cell line
    Effects of SPDJT and SMSPS on Cell Viability of RAW 264.7 Cell line
  • [Table 3.] Inhibitory Effects against NO Production of SPDJT and SMSPS on LPS-induced RAW 264.7 Cell line
    Inhibitory Effects against NO Production of SPDJT and SMSPS on LPS-induced RAW 264.7 Cell line
  • [Table 4.] DPPH Radical Scavenging Activity of SPDJT and SMSPS
    DPPH Radical Scavenging Activity of SPDJT and SMSPS